Summary

Gewinnung mesenchymaler Stammzellen aus menschlichem Nabelschnurgewebe und deren Differenzierung in die Skelettmuskellinie

Published: August 31, 2022
doi:

Summary

Wir beschreiben ein Protokoll zur Isolierung mesenchymaler Stammzellen aus menschlichem Nabelschnurgewebe und deren Differenzierung in die Skelettmuskellinie.

Abstract

Die Erforschung des therapeutischen Potenzials mesenchymaler Stammzellen hängt von der Leichtigkeit der Isolierung, der Potenz zur Differenzierung und der Zuverlässigkeit und Robustheit der Quelle ab. Wir beschreiben hier ein schrittweises Protokoll für die Isolierung mesenchymaler Stammzellen aus menschlichem Nabelschnurgewebe (uMSCs), deren Immunphänotypisierung und die Ausbreitung solcher Kulturen über mehrere Passagen. Bei diesem Verfahren ist die Lebensfähigkeit der uMSCs hoch, da keine enzymatische Verdauung stattfindet. Darüber hinaus stellt die Entfernung von Blutgefäßen, einschließlich der Nabelschnurarterien und der Vene, sicher, dass es keine Kontamination von Zellen endothelialen Ursprungs gibt. Unter Verwendung der Durchflusszytometrie sind uMSCs bei der Isolierung CD45CD34, was auf eine Abwesenheit von Zellen aus der hämatopoetischen Linie hinweist. Wichtig ist, dass sie die Tastenoberflächenmarkierungen CD105, CD90 und CD73 ausdrücken. Nach der Etablierung von Kulturen beschreibt dieses Papier eine effiziente Methode, um die Differenzierung dieser uMSCs in die Skelettmuskellinie zu induzieren. Eine detaillierte Analyse der myogenen Progression in differenzierten uMSCs zeigt, dass uMSCs Pax7 exprimieren, einen Marker für myogene Vorläufer in den Anfangsstadien der Differenzierung, gefolgt von der Expression von MyoD und Myf5 und schließlich einem terminalen Differenzierungsmarker, Myosin Heavy Chain (MyHC).

Introduction

Der menschlichen Nabelschnur wird ein robustes Reservoir mesenchymaler Stammzellen zugeschrieben, die derzeit aufgrund ihrer robusten Proliferations- und Differenzierungsraten, immunmodulatorischen Eigenschaften und ihrer Fähigkeit, Zellen aus allen drei Keimschichten 1 zu erzeugen, für regenerative Therapien erforschtwerden. Das Nabelschnurgewebe besteht aus mehreren Kompartimenten wie dem Nabelschnurblut, dem Nabelvenensubendothel und dem Wharton-Gelee (WJ), das an sich drei ununterschiedliche Regionen umfasst – die perivaskuläre Zone, die intervaskuläre Zone und das Subamnion oder die Nabelschnurauskleidung (CL)2. Während uMSCs aus all diesen verschiedenen Regionen isoliert werden können und wichtige MSC-Marker weitgehend ausdrücken, gibt es keine Klarheit darüber, ob diese Kompartimente die gleiche Population von uMSCs enthalten oder Unterschiede in ihren Differenzierungspotenzenaufweisen 3. Daher erfordern Protokolle für die Isolierung von uMSCs eine größere Präzision in ihrem Modus und Bereich der Isolation, die robuste Charakterisierung von Differenzierungspotentialen und schließlich eine vergleichende Analyse aus verschiedenen Kompartimenten der Schnur.

In diesem Zusammenhang haben nur wenige Studien Unterschiede in den proliferativen und differenzativen Potentialen von uMSC zwischen verschiedenen Teilen der Schnur gezeigt. Von diesen ergaben vergleichende Analysen zwischen uMSCs, die aus den CL- und WJ-Regionen isoliert wurden, ein größeres Proliferationspotenzial in CL-abgeleiteten uMSCs 3,4. In einer separaten Studie schnitten WJ-abgeleitete uMSCs in Proliferationsassays im Vergleich zu perivaskulären Zellen (HUCPV) besser ab.5. Bei der Untersuchung von Unterschieden zwischen aus Nabelschnurblut gewonnenen uMSCs und aus Nabelschnurgewebe gewonnenen uMSCs, die keine vaskuläre Kontamination aufweisen, wurde eine differentielle Expression der wichtigsten MSC-Marker zwischen den beiden Kompartimenten sowie erhöhte Proliferationsraten in Nabelschnurgewebe-abgeleiteten uMSCsberichtet 6.

Von den verschiedenen Studien, die die Differenzierungspotenziale von uMSCs hauptsächlich in Gewebe der Mesoderm-Linie wie osteogene, adipogene und chondrogene Linien untersuchen, haben nur sehr wenige detaillierte Protokolle für die myogene Differenzierung und anschließende Charakterisierung sowie vergleichende Analysen zwischen verschiedenen Nabelschnurkompartimenten geliefert. In diesem Zusammenhang haben wir ein robustes Muskeldifferenzierungsprotokoll entwickelt und beobachtet, dass aus Nabelschnurgewebe gewonnene uMSCs im Vergleich zu Nabelschnurblut überlegene myogene Differenzierungsfähigkeitenaufweisen 6. Hier wird ein schrittweises Protokoll für die Isolierung von uMSCs aus dem gesamten Nabelschnurgewebe ohne Zellen, die mit dem Gefäßsystem assoziiert sind, ihre Charakterisierung und ihre Differenzierung in die myogene Linie detailliert beschrieben.

Protocol

Die Verwendung von Nabelschnurgewebe in dieser Studie wurde vom Institutional Committee for Stem Cell Research (IC-SCR), dem Institutional Ethics Committee, dem Translational Health Science and Technology Institute (IEC-THSTI), dem Institutional Ethics Committee of Civil Hospital, Gurugram, Haryana, und dem Institutional Biosafety Committee, THSTI, genehmigt. Menschliche Nabelschnurgewebeproben wurden aus Terminlieferungen zum Zeitpunkt der Geburt entnommen. Von den Probanden wurde eine informierte schriftliche Zustimmun…

Representative Results

Der Erfolg der Isolierung von uMSCs aus Nabelschnurgewebe beträgt >95%, im Gegensatz zu den schlechten Erfolgsraten von Nabelschnurblut. Nach erfolgreicher Isolierung von uMSCs zeigt die FACS-Analyse, dass alle Zellen CD34−CD45−CD105+CD90+ sind. In der vergleichenden Analyse zeigen uMSCs, die aus Nabelschnurblut isoliert wurden, jedoch heterogene Populationen, wobei ein Teil der Zellen CD34 + CD45 + CD105 + (~ 15%) aufweist. Darüber hinaus…

Discussion

Kritische Schritte
Ein kritischer Schritt in diesem Protokoll ist die Sammlung von Gewebe unter aseptischen Bedingungen, vom Zeitpunkt der Lieferung bis zur Aufrechterhaltung steriler Kulturen, für die gesamte Dauer der Vermehrung. Während der Schnursammlung ist es wichtig, dass die Schnur keine nicht sterilisierte Oberfläche berührt und extern mit 70% Ethanol abgewischt wird, bevor sie in mit Antibiotika ergänzten Röhrchen, die PBS enthalten, gesammelt wird. Es ist wichtig, die Zeit zwischen de…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken Herrn Ojas Tikoo für ihre Hilfe bei den Dreharbeiten und der Videoproduktion. Wir danken auch für die Hilfe der Mitarbeiter von GARBH-Ini (Interdisciplinary Group on Advanced Research and Birth Outcome-DBT India), Krankenschwestern und leitenden Forschungsbeamten am Gurugram Civil Hospital und Dr. Pallavi Kshetrapal für Hilfe bei der Logistik. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse unterstützt, die Suchitra Gopinath vom Department of Biotechnology, Indien, gewährt wurden (BT/09/IYBA/2015; BT/PR29599/PFN/20/1393/2018).

Materials

4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Thermo Fisher Scientific D1306
Amphotericin B Sigma Aldrich A2411
Antibiotic solution 100x Liquid, endotoxin tested (10,000 U Penicillin and 10 mg Streptomycin/mL in 0.9% normal saline) HiMedia A001A-50mL
Anti-GAPDH antibody Sigma Aldrich G8795
Anti-MyHC antibody (My32) Novus Biologicals NBP2-50401AF647
Anti-MyoD antibody (5.8A) Novus Biologicals NB100-56511
Anti-Myogenin antibody (Clone F5D) Novus Biologicals NBP2-34616AF594
Anti-Pax7 antibody DSHB DSHB-C1-576
APC Mouse anti-human CD90 clone 5E10 BD Biosciences 559869
Collagen Type 1 Merck C8919
D (+) Glucose Sigma Aldrich G7021
Dexamethasone SIGMA D4902
FACSCanto II or FACSAria III BD Biosciences
Fetal Bovine Serum, qualified Brazil GIBCO 10270106 not to be heat-inactivated
FITC Mouse anti-human CD106 clone 51-10C9 BD Biosciences 551146
FITC Mouse anti-human CD14 clone M5E2 BD Biosciences 557153
FITC Mouse anti-human CD31 clone WM59 BD Biosciences 557508
FITC Mouse anti-human CD34 clone 581 BD Biosciences 555821
FITC Mouse anti-human CD45 clone HI30 BD Biosciences 555482
FITC Mouse anti-human CD49D clone 9F10 BD Biosciences 560840
FITC Mouse anti-human CD90 clone 5E10 BD Biosciences 555595
FITC Mouse anti-human HLA-A,B,C clone G46-2.6 BD Biosciences 557348
FITC Mouse anti-human IgG clone G18-145 BD Biosciences 555786
FlowJo software BD Biosciences
Gentamicin Sigma Aldrich G1264
Horse serum HiMedia RM1239
Hydrocortisone Merck H4001
Laminin Merck L2020
MEM Alpha Modification without L-glutamine, ribo- and deoxyribonucleosides Hyclone SH30568.FS Basal medium for uMSCs
PE Mouse anti-human CD105 clone 266 BD Biosciences 560839
PE Mouse anti-human CD44 clone 515 BD Biosciences 550989
PE Mouse anti-human CD49E clone llA1 BD Biosciences 555617
PE Mouse anti-human IgG clone G18-145 BD Biosciences 555787
PE-Cy7 Mouse anti-human CD73 CLONE AD2 BD Biosciences 561258
Phosphate buffered saline (PBS), pH=7.4 HiMedia M1866
Trypsin/EDTA solution (1x 0.25% Trypsin and 0.02% EDTA in Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) HiMedia TCL049-100mL

References

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Cite This Article
Sevak, J. K., Gopinath, S. D. Generation of Mesenchymal Stem Cells from Human Umbilical Cord Tissue and their Differentiation into the Skeletal Muscle Lineage. J. Vis. Exp. (186), e63725, doi:10.3791/63725 (2022).

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