Generering av mesenchymale stamceller fra humant navlestrengsvev og deres differensiering i skjelettmuskelens avstamning
Summary
Vi beskriver en protokoll for isolering av mesenchymale stamceller fra humant navlestrengsvev og deres differensiering i skjelettmuskellinjen.
Abstract
Å utforske det terapeutiske potensialet til mesenchymale stamceller er betinget av enkel isolasjon, styrke mot differensiering og kildens pålitelighet og robusthet. Vi beskriver her en trinnvis protokoll for isolering av mesenchymale stamceller fra humant navlestrengsvev (uMSCs), deres immunofenotyping og forplantning av slike kulturer over flere passasjer. I denne prosedyren er levedyktigheten til uMSCene høy fordi det ikke er noen enzymatisk fordøyelse. Videre sikrer fjerning av blodkar, inkludert navlestrengsarteriene og venen, at det ikke er forurensning av celler av endotel opprinnelse. Ved hjelp av strømningscytometri er uMSCer ved isolasjon CD45-CD34−, noe som indikerer fravær av celler fra den hematopoietiske avstamningen. Det er viktig at de uttrykker viktige overflatemarkører, CD105, CD90 og CD73. Ved etablering av kulturer beskriver denne artikkelen en effektiv metode for å indusere differensiering i disse uMSCene i skjelettmuskellinjen. En detaljert analyse av myogen progresjon i differensierte uMSCer avslører at uMSCs uttrykker Pax7, en markør for myogene forfedre i de første stadiene av differensiering, etterfulgt av uttrykket myoD og Myf5, og til slutt en terminal differensieringsmarkør, myosin tung kjede (MyHC).
Introduction
Den menneskelige navlestrengen har blitt kreditert for å ha et robust reservoar av mesenchymale stamceller, som for tiden utforskes for regenerative terapier på grunn av deres robuste sprednings- og differensieringshastigheter, immunmodulerende egenskaper og evne til å generere celler fra alle de tre bakterielagene1. Navlestrengsvevet består av flere rom som navlestrengsblodet, navlestrengsunderen og Whartons gelé (WJ), som i seg selv omfatter tre utydelige regioner – perivascularsonen, den intervaskulære sonen og sub-amnion eller ledningsforingen (CL)2. Selv om uMSCer kan isoleres fra alle disse forskjellige regionene og bredt uttrykke viktige MSC-markører, er det ingen klarhet i om disse rommene inneholder samme populasjon av uMSCer eller viser forskjeller i differensieringspottencies3. Derfor krever protokoller for isolering av uMSCer en større presisjon i deres modus og isolasjonsområde, den robuste karakteriseringen av differensieringspotensialer, og til slutt en komparativ analyse fra forskjellige rom i ledningen.
I denne sammenhengen har få studier vist forskjeller i uMSC proliferative og differensierende potensialer mellom ulike deler av ledningen. Av disse viste komparative analyser mellom uMSCer isolert fra CL- og WJ-regionene et større proliferativt potensial i CL-avledede uMSCer 3,4. I en egen studie presterte WJ-avledede uMSCer bedre i proliferasjonsanalyser sammenlignet med perivasculære celler (HUCPV)5. Ved å undersøke forskjeller mellom blodavledede uMSCer og hjertevevsavledede uMSCer uten vaskulær forurensning, ble det rapportert forskjellsuttrykk for viktige MSC-markører mellom de to rommene, samt økte spredningshastigheter i ledningsvevsavledede uMSCer6.
Av de flere studiene som undersøker differensieringspotensialene til uMSCer primært i vev av mesoderm-slekten som osteogen, adipogene og kondrogene avstamninger, har svært få gitt detaljerte protokoller for myogen differensiering og etterfølgende karakterisering, samt komparative analyser mellom ulike ledningsrom. I denne sammenhengen har vi utviklet en robust muskeldifferensieringsprotokoll og observert at ledningsvevsavledede uMSCer viser overlegne myogene differensieringsevner sammenlignet med ledningsblod6. Her er en trinnvis protokoll detaljert for isolering av uMSCer fra hele ledningsvevet uten celler forbundet med vaskulaturen, deres karakterisering og deres differensiering i den myogene avledningen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kritiske trinn
Et kritisk skritt i denne protokollen er innsamling av vev under aseptiske forhold, fra leveringstidspunktet til vedlikehold av sterile kulturer, for hele varigheten av forplantningen. Under ledningsoppsamling er det viktig at ledningen ikke berører noen ikke-sterilisert overflate og er eksternt vattstein med 70% etanol før oppsamling i rør som inneholder PBS supplert med antibiotika. Det er viktig å begrense tiden mellom ledningsoppsamling og behandling av vevet for uMSC-isolasjon….
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Mr. Ojas Tikoo for deres hjelp med filming og videoproduksjon. Vi anerkjenner også hjelpen mottatt fra GARBH-Ini (Interdisciplinary Group on Advanced Research and Birth Outcome-DBT India) ansatte, sykepleiere og seniorforskere ved Gurugram Civil Hospital og Dr. Pallavi Kshetrapal for hjelp med logistikk. Dette arbeidet ble støttet av tilskudd tildelt Suchitra Gopinath fra Institutt for bioteknologi, India (BT/09/IYBA/2015; BT/PR29599/PFN/20/1393/2018).
Materials
| 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| Amphotericin B | Sigma Aldrich | A2411 | |
| Antibiotic solution 100x Liquid, endotoxin tested (10,000 U Penicillin and 10 mg Streptomycin/mL in 0.9% normal saline) | HiMedia | A001A-50mL | |
| Anti-GAPDH antibody | Sigma Aldrich | G8795 | |
| Anti-MyHC antibody (My32) | Novus Biologicals | NBP2-50401AF647 | |
| Anti-MyoD antibody (5.8A) | Novus Biologicals | NB100-56511 | |
| Anti-Myogenin antibody (Clone F5D) | Novus Biologicals | NBP2-34616AF594 | |
| Anti-Pax7 antibody | DSHB | DSHB-C1-576 | |
| APC Mouse anti-human CD90 clone 5E10 | BD Biosciences | 559869 | |
| Collagen Type 1 | Merck | C8919 | |
| D (+) Glucose | Sigma Aldrich | G7021 | |
| Dexamethasone | SIGMA | D4902 | |
| FACSCanto II or FACSAria III | BD Biosciences | ||
| Fetal Bovine Serum, qualified Brazil | GIBCO | 10270106 | not to be heat-inactivated |
| FITC Mouse anti-human CD106 clone 51-10C9 | BD Biosciences | 551146 | |
| FITC Mouse anti-human CD14 clone M5E2 | BD Biosciences | 557153 | |
| FITC Mouse anti-human CD31 clone WM59 | BD Biosciences | 557508 | |
| FITC Mouse anti-human CD34 clone 581 | BD Biosciences | 555821 | |
| FITC Mouse anti-human CD45 clone HI30 | BD Biosciences | 555482 | |
| FITC Mouse anti-human CD49D clone 9F10 | BD Biosciences | 560840 | |
| FITC Mouse anti-human CD90 clone 5E10 | BD Biosciences | 555595 | |
| FITC Mouse anti-human HLA-A,B,C clone G46-2.6 | BD Biosciences | 557348 | |
| FITC Mouse anti-human IgG clone G18-145 | BD Biosciences | 555786 | |
| FlowJo software | BD Biosciences | ||
| Gentamicin | Sigma Aldrich | G1264 | |
| Horse serum | HiMedia | RM1239 | |
| Hydrocortisone | Merck | H4001 | |
| Laminin | Merck | L2020 | |
| MEM Alpha Modification without L-glutamine, ribo- and deoxyribonucleosides | Hyclone | SH30568.FS | Basal medium for uMSCs |
| PE Mouse anti-human CD105 clone 266 | BD Biosciences | 560839 | |
| PE Mouse anti-human CD44 clone 515 | BD Biosciences | 550989 | |
| PE Mouse anti-human CD49E clone llA1 | BD Biosciences | 555617 | |
| PE Mouse anti-human IgG clone G18-145 | BD Biosciences | 555787 | |
| PE-Cy7 Mouse anti-human CD73 CLONE AD2 | BD Biosciences | 561258 | |
| Phosphate buffered saline (PBS), pH=7.4 | HiMedia | M1866 | |
| Trypsin/EDTA solution (1x 0.25% Trypsin and 0.02% EDTA in Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | HiMedia | TCL049-100mL |
References
- Kuroda, Y., et al. Unique multipotent cells in adult human mesenchymal cell populations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (19), 8639-8643 (2010).
- Troyer, D. L., Weiss, M. L. Wharton’s jelly-derived cells are a primitive stromal cell population. Stem Cells. 26 (3), 591-599 (2008).
- Karahuseyinoglu, S., et al. Biology of stem cells in human umbilical cord stroma: In situ and in vitro surveys. Stem Cells. 25 (2), 319-331 (2007).
- Kita, K., Gauglitz, G. G., Phan, T. T., Herndon, D. N., Jeschke, M. G. Isolation and characterization of mesenchymal stem cells from the sub-amniotic human umbilical cord lining membrane. Stem Cells and Development. 19 (4), 491-502 (2010).
- Sarugaser, R., Lickorish, D., Baksh, D., Hosseini, M. M., Davies, J. E. Human umbilical cord perivascular (HUCPV) cells: A source of mesenchymal progenitors. Stem Cells. 23 (2), 220-229 (2005).
- Mishra, S., et al. Umbilical cord tissue is a robust source for mesenchymal stem cells with enhanced myogenic differentiation potential compared to cord blood. Scientific Reports. 10 (1), 18978 (2020).
- Lu, L. L., et al. Isolation and characterization of human umbilical cord mesenchymal stem cells with hematopoiesis-supportive function and other potentials. Haematologica. 91 (8), 1017-1026 (2006).
- Seshareddy, K., Troyer, D., Weiss, M. L. Method to isolate mesenchymal-like cells from Wharton’s Jelly of umbilical cord. Methods in Cell Biology. 86, 101-119 (2008).
- Sotiropoulou, P. A., Perez, S. A., Salagianni, M., Baxevanis, C. N., Papamichail, M. Characterization of the optimal culture conditions for clinical scale production of human mesenchymal stem cells. Stem Cells. 24 (2), 462-471 (2006).
- Yoon, J. H., et al. Comparison of explant-derived and enzymatic digestion-derived MSCs and the growth factors from Wharton’s jelly. BioMed Research International. 2013, 428726 (2013).
- Ishige, I., et al. Comparison of mesenchymal stem cells derived from arterial, venous, and Wharton’s jelly explants of human umbilical cord. International Journal of Hematology. 90 (2), 261-269 (2009).
- Chal, J., et al. Differentiation of pluripotent stem cells to muscle fiber to model Duchenne muscular dystrophy. Nature Biotechnology. 33 (9), 962-969 (2015).
