Generering af mesenkymale stamceller fra humant navlesnorvæv og deres differentiering i skeletmuskellinjen

Summary

Vi beskriver en protokol for isolering af mesenkymale stamceller fra humant navlesnorsvæv og deres differentiering i skeletmuskelslægten.

Abstract

Udforskning af det terapeutiske potentiale af mesenkymale stamceller er betinget af den lette isolering, styrke mod differentiering og kildens pålidelighed og robusthed. Vi beskriver her en trinvis protokol til isolering af mesenkymale stamceller fra humant navlesnorsvæv (UMSC’er), deres immunophenotyping og formering af sådanne kulturer over flere passager. I denne procedure er levedygtigheden af uMSC’erne høj, fordi der ikke er nogen enzymatisk fordøjelse. Endvidere sikrer fjernelsen af blodkar, herunder navlestrengsarterierne og venen, at der ikke er nogen forurening af celler af endoteloprindelse. Ved anvendelse af flowcytometri er uMSC’er ved isolering CD45-CD34^–, hvilket indikerer et fravær af celler fra den hæmatopoietiske afstamning. Det er vigtigt, at de udtrykker vigtige overflademarkører, CD105, CD90 og CD73. Ved etablering af kulturer beskriver dette papir en effektiv metode til at inducere differentiering i disse uMSC’er i skeletmuskelslægten. En detaljeret analyse af myogen progression i differentierede uMSC’er afslører, at uMSC’er udtrykker Pax7, en markør for myogene forfædre i de indledende stadier af differentiering, efterfulgt af ekspressionen af MyoD og Myf5, og endelig en terminal differentieringsmarkør, myosin tung kæde (MyHC).

Introduction

Den menneskelige navlestreng er blevet krediteret for at have et robust reservoir af mesenkymale stamceller, som i øjeblikket undersøges til regenerative terapier på grund af deres robuste proliferations- og differentieringshastigheder, immunmodulerende egenskaber og evne til at generere celler fra alle de tre kimlag¹. Navlestrengsvævet består af flere rum såsom navlesnorsblodet, navlestrengsunderendotelet og Whartons gelé (WJ), som i sig selv omfatter tre utydelige regioner – den perivaskulære zone, den intervaskulære zone og underamnionen eller ledningsforingen (CL)². Mens uMSC’er kan isoleres fra alle disse forskellige regioner og bredt udtrykke vigtige MSC-markører, er der ingen klarhed over, om disse rum indeholder den samme population af uMSC’er eller viser forskelle i deres differentieringsstyrker³. Derfor kræver protokoller til isolering af uMSC’er en større præcision i deres isolationstilstand og -region, den robuste karakterisering af differentieringspotentialer og endelig en sammenlignende analyse fra forskellige rum i ledningen.

I denne sammenhæng har få undersøgelser vist forskelle i uMSC proliferative og differentiative potentialer mellem forskellige dele af ledningen. Af disse afslørede sammenlignende analyser mellem uMSC’er isoleret fra CL- og WJ-regionerne et større proliferativt potentiale i CL-afledte uMSC’er ^3,4. I en separat undersøgelse klarede WJ-afledte uMSC’er sig bedre i proliferationsassays sammenlignet med perivaskulære celler (HUCPV)⁵. Ved undersøgelse af forskelle mellem navlestrengsblodafledte uMSC’er og navlestrengsvævsafledte uMSC’er uden vaskulær kontaminering blev der rapporteret differentiel ekspression af vigtige MSC-markører mellem de to rum samt øgede proliferationshastigheder i navlestrengsvævsafledte uMSC’er⁶.

Af de mange undersøgelser, der undersøgte differentieringspotentialerne for uMSC’er primært i væv af mesoderm-slægten, såsom osteoogene, adipogene og kondrogogene afstamninger, har meget få givet detaljerede protokoller for myogen differentiering og efterfølgende karakterisering samt sammenlignende analyser mellem forskellige ledningsrum. I denne sammenhæng har vi udviklet en robust muskeldifferentieringsprotokol og observeret, at navlestrengsvævsafledte uMSC’er viser overlegne myogene differentieringsevner sammenlignet med navlestrengsblod⁶. Her er en trinvis protokol detaljeret til isolering af uMSC’er fra hele ledningsvævet uden celler forbundet med vaskulaturen, deres karakterisering og deres differentiering i den myogene afstamning.

Protocol

Brugen af navlesnorvæv i denne undersøgelse blev godkendt af Institutional Committee for Stem Cell Research (IC-SCR), Institutional Ethics Committee, Translational Health Science and Technology Institute (IEC-THSTI), Institutional Ethics Committee of Civil Hospital, Gurugram, Haryana og Institutional Biosafety Committee, THSTI. Humane ledningsvævsprøver blev høstet fra terminsleverancer på fødselstidspunktet. Informeret skriftligt samtykke blev indhentet fra forsøgspersoner . Alle metoder blev udført i overensst…

Representative Results

Succesen med isolering af uMSC’er fra ledningsvæv er >95%, i modsætning til de dårlige succesrater fra fuldsnorsblod. Efter vellykket isolering af uMSC’er afslører FACS-analyse, at alle cellerne er CD34−CD45−CD105+CD90+. I komparativ analyse viser uMSC’er isoleret fra navlestrengsblod imidlertid heterogene populationer, hvor en andel af cellerne viser CD34 + CD45 + CD105 + (~ 15%). Derudover er dobbeltpositiv CD105 + CD90 <sup…

Discussion

Kritiske trin
Et kritisk trin i denne protokol er indsamling af væv under aseptiske forhold, fra leveringstidspunktet til vedligeholdelse af sterile kulturer, i hele formeringsvarigheden. Under ledningsopsamling er det vigtigt, at ledningen ikke rører nogen ikke-steriliseret overflade og podes eksternt med 70% ethanol inden opsamling i rør indeholdende PBS suppleret med antibiotika. Det er vigtigt at begrænse tiden mellem ledningsopsamling og behandling af vævet til uMSC-isolering. Hvis der er be…

Materials

4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Thermo Fisher Scientific	D1306
Amphotericin B	Sigma Aldrich	A2411
Antibiotic solution 100x Liquid, endotoxin tested (10,000 U Penicillin and 10 mg Streptomycin/mL in 0.9% normal saline)	HiMedia	A001A-50mL
Anti-GAPDH antibody	Sigma Aldrich	G8795
Anti-MyHC antibody (My32)	Novus Biologicals	NBP2-50401AF647
Anti-MyoD antibody (5.8A)	Novus Biologicals	NB100-56511
Anti-Myogenin antibody (Clone F5D)	Novus Biologicals	NBP2-34616AF594
Anti-Pax7 antibody	DSHB	DSHB-C1-576
APC Mouse anti-human CD90 clone 5E10	BD Biosciences	559869
Collagen Type 1	Merck	C8919
D (+) Glucose	Sigma Aldrich	G7021
Dexamethasone	SIGMA	D4902
FACSCanto II or FACSAria III	BD Biosciences
Fetal Bovine Serum, qualified Brazil	GIBCO	10270106	not to be heat-inactivated
FITC Mouse anti-human CD106 clone 51-10C9	BD Biosciences	551146
FITC Mouse anti-human CD14 clone M5E2	BD Biosciences	557153
FITC Mouse anti-human CD31 clone WM59	BD Biosciences	557508
FITC Mouse anti-human CD34 clone 581	BD Biosciences	555821
FITC Mouse anti-human CD45 clone HI30	BD Biosciences	555482
FITC Mouse anti-human CD49D clone 9F10	BD Biosciences	560840
FITC Mouse anti-human CD90 clone 5E10	BD Biosciences	555595
FITC Mouse anti-human HLA-A,B,C clone G46-2.6	BD Biosciences	557348
FITC Mouse anti-human IgG clone G18-145	BD Biosciences	555786
FlowJo software	BD Biosciences
Gentamicin	Sigma Aldrich	G1264
Horse serum	HiMedia	RM1239
Hydrocortisone	Merck	H4001
Laminin	Merck	L2020
MEM Alpha Modification without L-glutamine, ribo- and deoxyribonucleosides	Hyclone	SH30568.FS	Basal medium for uMSCs
PE Mouse anti-human CD105 clone 266	BD Biosciences	560839
PE Mouse anti-human CD44 clone 515	BD Biosciences	550989
PE Mouse anti-human CD49E clone llA1	BD Biosciences	555617
PE Mouse anti-human IgG clone G18-145	BD Biosciences	555787
PE-Cy7 Mouse anti-human CD73 CLONE AD2	BD Biosciences	561258
Phosphate buffered saline (PBS), pH=7.4	HiMedia	M1866
Trypsin/EDTA solution (1x 0.25% Trypsin and 0.02% EDTA in Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)	HiMedia	TCL049-100mL