Blodplaterikt plasmalysat for behandling av øyeoverflatesykdommer

Summary

Blodplatelysater representerer et fremvoksende verktøy for behandling av okulære overflatesykdommer. Her foreslår vi en metode for fremstilling, dispensasjon, lagring og karakterisering av blodplatelysat samlet fra blodplatedonorer.

Abstract

Ulike okulære overflatesykdommer behandles med blodavledede øyedråper. Deres bruk har blitt introdusert i klinisk praksis på grunn av deres metabolitt og vekstfaktorinnhold, noe som fremmer øyeoverflateregenerering. Blodbaserte øyedråper kan fremstilles fra forskjellige kilder (dvs. donasjon av fullblod eller blodplateaferese), samt med forskjellige protokoller (f.eks. forskjellige fortynninger og fryse / tine sykluser). Denne variasjonen hemmer standardiseringen av kliniske protokoller og dermed evalueringen av deres kliniske effekt. Utdyping og deling av de metodiske prosedyrene kan bidra til å definere felles retningslinjer. I løpet av de siste årene har allogene produkter spredt seg som et alternativ til de autologe behandlingene siden de garanterer høyere effektstandarder; blant dem fremstilles de blodplaterike plasmalysatene (PRP-L) med enkle produksjonsprosedyrer. I transfusjonsmedisinsk enhet ved AUSL-IRCCS di Reggio Emilia, Italia, oppnås PRP-L ved blodplate-aferesedonasjon. Dette produktet fortynnes initialt til 0,3 x 10 9 blodplater/ml (med utgangspunkt i en gjennomsnittlig konsentrasjon på 1 x 10 9 blodplater/ml) i^0,9 % NaCl. Fortynnede blodplater fryses/tines og deretter sentrifugeres for å eliminere rusk. Det endelige volumet deles i 1,45 ml aliquots og lagres ved -80 °C. Før de blir dispensert til pasienter, testes øyedråper for sterilitet. Pasienter kan oppbevare blodplatelysater ved −15 °C i opptil 1 måned. Sammensetningen av vekstfaktoren vurderes også ut fra tilfeldig utvalgte aliquoter, og gjennomsnittsverdiene rapporteres her.

Introduction

Blodavledede produkter er mye brukt i sårpleie¹, maxillofacial og ortopedisk kirurgi, og for behandling av forskjellige okulære overflatesykdommer² som tørr øyesykdom (DED)³. I DED svekkes tårfilmhomeostase som følge av unormal funksjon av ulike faktorer involvert i tåreproduksjon og okulær overflateintegritet ^4,5.

DED er preget av heterogenitet i årsaker og alvorlighetsgrad ^6,7,8 og kan være en konsekvens av ulike faktorer som aldring, kjønn⁹, kontaktlinser^, aktuelle eller systemiske medisiner 10, eller eksisterende forhold som Sjøgrens syndrom ¹⁰. Til tross for å ha milde symptomer, påvirker DED millioner av mennesker over hele verden, noe som påvirker livskvaliteten og helsesystemet også⁶.

Mange behandlinger er rapportert for denne patologien, men det er fortsatt ingen konsensus om den mest effektive løsningen¹². Til dags dato er kunstige tårer den første behandlingslinjen som tar sikte på å gjenopprette den vandige sammensetningen av tårfilmen, selv om disse erstatningene ikke inneholder de viktigste biologisk aktive oppløsningene av naturlige tårer ^6,11. Blodplatebaserte produkter anses som et gyldig alternativ^12,13 til kunstige tårer, selv om deres kliniske effekt^, anbefalinger for bruk og preparatmetoder fortsatt er gjenstand for debatt³.

Blodbaserte produkter deler med tårer en lignende sammensetning når det gjelder metabolitter¹⁴, proteiner, lipider, vitaminer, ioner, vekstfaktorer (GF), antioksidantforbindelser 11 og osmolaritet (300 mOsm / L)¹¹. Gjennom den synergistiske aktiviteten til komponentene fremmer de regenerering av hornhinneepitelet, hemmer frigivelsen av inflammatoriske cytokiner og øker antall begerceller og uttrykket av muciner i bindehinden ^2,3.

Så langt har heterogenitet i oftalmiske blodbaserte produkter blitt dokumentert i litteraturen; Disse produktene kan klassifiseres i henhold til blodgivernes opprinnelse, dvs. autolog eller allogen, samt blodkilden, dvs. perifert blod, ledningsblod, serum eller blodplater.

Selv om autologe produkter var de mest utbredte³, blir allogene nå det foretrukne valget, siden de sikrer høyere effekt- og sikkerhetsstandarder 15, sammen med en betydelig reduksjon i kostnadene^16,17. Tidligere studier viste faktisk at blodbaserte produkter hentet fra pasienter med autoimmune og / eller systemiske sykdommer kan vise endret kvalitet og funksjonalitet 6,16,17. Til tross for at serumbaserte øyedråper er de mest utbredte, er blodplatebaserte produkter nylig blitt bekreftet som et gyldig alternativ, da de lett kan tilberedes samtidig som de opprettholder betydelige nivåer av effekt ^3,11. Dagens tilgjengelige blodplatebaserte produkter kan deles inn i blodplaterikt plasma (PRP), blodplaterikt plasmalysat (PRP-L) og plasma rikt på vekstfaktorer (PRGF)³.

Blant dem har PRP-L fordelen av å være et frosset produkt med lang levetid. PRP-L kan fremstilles fra aferese, buffy-strøk, eller til og med fra utløpende blodplater (PLT)^18,19, noe som reduserer svinnet verdifullt. Aliquotene kan lagres i flere måneder i blodtransfusjonssentrene ved -80 ° C eller til og med hjemme hos pasienter ved -15 ° C i kortere perioder.

PRP-L er svært beriket i GFs, som har vist seg å stimulere øyeoverflateregenerering 12,20,21. Likevel er det bare få rapporterte kliniske studier på dette området, og alle brukte autologe kilder ^3,22. PRP-L trenger fortsatt ytterligere validering og karakterisering før den rutinemessig kan brukes til behandling av øyeoverflatesykdommer, siden det ikke finnes standardiserte retningslinjer for forberedelse, dispensasjon og lagring³.

Her deles en detaljert protokoll for produksjon av PRP-L som brukes ved Transfusjonsmedisinsk enhet i AUSL-IRCCS di Reggio Emilia, Italia, og dispensasjon til pasienter med DED. Vi tar sikte på å hjelpe det vitenskapelige samfunn til å utvikle standardmetoder for fremstilling, noe som kan øke homogenitet og konsistens i verdensomspennende studier og kliniske tilnærminger.

Protocol

PRP-L brukt til kvantitativ vurdering av vekstfaktorer ble samlet inn i en bredere studie om karakterisering av PRP-produkter for regenerative formål, utført ved AUSL-IRCCS di Reggio Emilia og godkjent av Area Vasta Emilia Nord Ethical Committee 10. januar 2019 (protokollnummer 2019/0003319). Giverne ga sitt informerte samtykke i henhold til Helsinkideklarasjonen. Ingen etisk godkjenning var nødvendig for å samle inn aggregerte, anonyme data fra OSDI-spørreskjemaet (Ocular Surface Disease Index), som rutinemessig br…

Representative Results

Begrunnelsen for bruk av serumavledede øyedråper (som er det blodbaserte produktet som oftest brukes til behandling av øyeoverflatesykdommer) ligger i innholdet av GFs, som er nesten helt avledet fra sirkulerende blodplater. PRP inneholder et signifikant høyere antall blodplater (og følgelig blodplatederiverte GFs) sammenlignet med perifert blodserum, som varierer mellom 0,15 x 10 9-0,45 x 109 PLTs / ml. I henhold til italienske lover skal blodplatetallet i PRP-enheter være minst 0,9 x 10 9-1<…

Discussion

I de senere år har den kliniske bruken av blodplatebaserte produkter for okulære overflatepatologier økt, men deres diffusjon hindres av mangel på vitenskapelig robusthet. Dette skyldes hovedsakelig bred heterogenitet i donorkilder og forberedelsesprotokoller, som ofte ikke er fullstendig avslørt eller ikke spesielt designet for det formål de er dispensert for. Spesielt mangler fortsatt informasjon om blodplatebaserte produkter samlet inn ved aferese. Målet med dette arbeidet var derfor å beskrive den trinnvise b…

Materials

Equipments
CompoSeal Mobilea II	Fresenius Kabi, Germany		bag sealer
HeraSafe hood	Heraeus Instruments, Germany		Class II biohazard hood
MCS+ 9000 Mobile Platelet Collection System	Haemonetics, Italy		automated plasma and multicomponent collection equipment for donating platelet, red cell, plasma, or combination blood components
Platelet shaker, PF396i	Helmer, USA		Platelet shaker
Raycell X-ray Blood Irradiator	MDS Nordion, Canada		X-ray Blood Irradiator
ROTIXA 50RS	Hettich Zentrifugen, Germany		High speed entrifuge
Sysmex XS-1000i	Sysmex Europe GMBH, Germany		haemocytometer for platelet count
Warm bath, WB-M15	Falc Instruments, Italy		Warm bath
Materials
ACD-A anticoagulant solution A	Fenwal Inc., USA	DIN 00788139	anticoagulant solution for platelet apheresis (1000 ml)
BD BACTEC Peds Plus/F Culture vials	BD Biosciences, USA	BD 442020	Sterility assay
BD BACTEC Peds Plus/F Culture vials	BD Biosciences, USA	442020	At least 2 vials for sterility assay
BD Luer Lok Syringe	BD Plastipack, USA	300865	At least 4 sterile syringes (50 ml)
Bio-Plex Human Cancer Panel 1	BioRad Laboratories, USA	171AC500M	Standard panel for PDGF isoforms assessment
Bio-Plex Human Cancer Panel 2	BioRad Laboratories, USA	171AC600M	Standard panel for EGF assessment
Bio-Plex MAGPIX Multiplex Reader	BioRad Laboratories, USA	Magpix	This instrument allows multiple immunoassays using functionalized magnetic beads.
Bio-Plex Pro TGF-b Assay	BioRad Laboratories, USA	10024984	Set and standards for TGFb isoforms assessment
BioRet	ARIES s.r.l., Italy	A2DH0020	At least 4 piercing spike for blood bags
Blood collection tube	BD Vacutainer, USA	367835	1 tube, necessary to perform platelet counts
Eye drops kit. COL Medical Device for the application and preservation of eye drops from haemocomponents	Biomed Device s.r.l., Italy	COLC50	Eye drops kit. At least 2 kits for each PRP unit collected
Human Cancer PDGF-AB/BB Set 1x96well	BioRad Laboratories, USA	171BC511	Set for PDGF isoforms assessment
Human Cancer2 EGF Set 1x96well	BioRad Laboratories, USA	171BC603M	Set for EGF assessment
NaCl 0.9% sterile solution	Baxter S.p.A., Italy	B05BB01	1000 ml
OSDI Questionnaire	Allergan Inc., USA	OSDI	Ocular Surface Disease Index Questionnaire
Piercing spike	BioRet ARIES s.r.l., Italy	BS051004	Spike
Platelet Additive Solution A+ T-PAS+	TERUMO BCT Inc., Italy	40842	preservative solution for platelet concentrates (1000 ml)
Software Excel	Microsoft, USA	Excel	Data analysis software
Teruflex Transfer bag 1000 ml	TERUMO BCT Inc., Italy	BB*T100BM	1 for PRP dilution
Teruflex Transfer bag 300 ml	TERUMO BCT Inc., Italy	BB*030CM	At least 6 for each PRP unit collected