Lisado Plasmático Rico em Plaquetas para Tratamento de Doenças da Superfície Ocular

Summary

Os lisados plaquetários representam uma ferramenta emergente para o tratamento de doenças da superfície ocular. Aqui, propomos um método para o preparo, dispensação, armazenamento e caracterização do lisado plaquetário coletado de doadores de plaquetas.

Abstract

Várias doenças da superfície ocular são tratadas com colírios derivados do sangue. Seu uso foi introduzido na prática clínica por causa de seu conteúdo de metabólito e fator de crescimento, o que promove a regeneração da superfície ocular. Os colírios à base de sangue podem ser preparados a partir de diferentes fontes (ou seja, doação de sangue total ou aférese plaquetária), bem como com diferentes protocolos (por exemplo, diferentes diluições e ciclos de congelamento/descongelamento). Essa variabilidade dificulta a padronização dos protocolos clínicos e, consequentemente, a avaliação de sua eficácia clínica. O pormenor e a partilha dos procedimentos metodológicos podem contribuir para a definição de orientações comuns. Nos últimos anos, os produtos alogênicos vêm se difundindo como alternativa aos tratamentos autólogos, uma vez que garantem maiores padrões de eficácia; entre eles, os colírios de lisado plasmático rico em plaquetas (PRP-L) são preparados com procedimentos de fabricação simples. Na unidade de medicina transfusional da AUSL-IRCCS di Reggio Emilia, Itália, o PRP-L é obtido a partir da doação de aférese plaquetária. Este produto é inicialmente diluído a 0,3 x 10 9 plaquetas/mL (a partir de uma concentração média de 1 x 10 9 plaquetas/mL) em NaCl a^0,9%. As plaquetas diluídas são congeladas/descongeladas e, posteriormente, centrifugadas para eliminar detritos. O volume final é dividido em alíquotas de 1,45 mL e armazenado a -80 °C. Antes de serem dispensados aos pacientes, os colírios são testados quanto à esterilidade. Os pacientes podem armazenar lisados plaquetários a -15 °C por até 1 mês. A composição do fator de crescimento também é avaliada a partir de alíquotas selecionadas aleatoriamente, e os valores médios são relatados aqui.

Introduction

Os produtos derivados do sangue são amplamente utilizados no cuidado de feridas¹, cirurgia maxilofacial e ortopédica e para o tratamento de diferentes doenças da superfície ocular², como a doença do olho seco (DED)³. Na DED, a homeostase do filme lacrimal é prejudicada como consequência do funcionamento anormal de diferentes fatores envolvidos na produção de lágrimas e na integridade da superfície ocular ^4,5.

A DED é caracterizada por heterogeneidade de causas e gravidade ^6,7,8 e pode ser consequência de diferentes fatores como envelhecimento, sexo⁹, lentes de contato^, medicamentos tópicos ou sistêmicos 10 ou condições pré-existentes como a síndrome de Sjögren ¹⁰. Apesar de apresentar sintomas leves, a DED acomete milhões de pessoas em todo o mundo, impactando sua qualidade de vida e também o sistema de saúde⁶.

Muitos tratamentos têm sido relatados para essa patologia, mas ainda não há consenso sobre a solução mais eficaz¹². Até o momento, as lágrimas artificiais são a primeira linha de terapia voltada para restaurar a composição aquosa do filme lacrimal, embora esses substitutos não contenham os principais solutos biologicamente ativos das lágrimas naturais ^6,11. Os produtos à base de plaquetas são considerados uma alternativa válida^12,13 às lágrimas artificiais, embora sua eficácia clínica^, recomendações de uso e métodos de preparação ainda sejam motivo de debate³.

Os produtos à base de sangue compartilham com as lágrimas uma composição semelhante em termos de metabólitos¹⁴, proteínas, lipídios, vitaminas, íons, fatores de crescimento (GFs), compostos antioxidantes 11 e osmolaridade (300 mOsm/L)¹¹. Por meio da atividade sinérgica de seus componentes, promovem a regeneração do epitélio corneano, inibem a liberação de citocinas inflamatórias e aumentam o número de células caliciformes e a expressão de mucinas na conjuntiva ^2,3.

Até o momento, a heterogeneidade em produtos oftálmicos à base de sangue tem sido documentada na literatura; esses produtos podem ser classificados de acordo com a origem do doador de sangue, ou seja, autólogo ou alogênico, bem como a fonte sanguínea, ou seja, sangue periférico, sangue do cordão umbilical, soro ou plaquetas.

Embora os produtos autólogos tenham sido os mais difundidos³, os alogênicos estão se tornando a escolha preferida, uma vez que garantem maiores padrões de eficácia e segurança 15, juntamente com uma redução significativa nos custos^16,17. Estudos prévios, de fato, comprovaram que produtos à base de sangue obtidos de pacientes com doenças autoimunes e/ou sistêmicas podem apresentar qualidade e funcionalidade alteradas 6,16,17. Apesar de os colírios à base de soro serem os mais difundidos, os produtos à base de plaquetas estão se firmando recentemente como uma alternativa válida, pois podem ser facilmente preparados mantendo níveis significativos de eficácia ^3,11. Os produtos à base de plaquetas atualmente disponíveis podem ser divididos em plasma rico em plaquetas (PRP), lisado plasmático rico em plaquetas (PRP-L) e plasma rico em fatores de crescimento (PRGF)³.

Entre eles, o PRP-L tem a vantagem de ser um produto congelado de longa duração. O PRP-L pode ser preparado a partir de aférese, buffy-coats, ou mesmo de plaquetas expirantes (PLTs)^18,19, reduzindo preciosamente seu desperdício. As alíquotas podem ser armazenadas por meses nos centros de transfusões de sangue a -80 °C ou mesmo nas casas dos pacientes a -15 °C por períodos mais curtos.

Os PRP-L são altamente enriquecidos em FGs, que comprovadamente estimulam a regeneração da superfície ocular ^12,20,21. No entanto, são poucos os estudos clínicos relatados nessa área, e todos utilizaram fontes autólogas ^3,22. O PRP-L ainda necessita de validação e caracterização adicionais antes de poder ser utilizado rotineiramente para o tratamento de doenças da superfície ocular, uma vez que não existem diretrizes padronizadas para sua preparação, dispensação e armazenamento³.

Neste documento, um protocolo detalhado é compartilhado para a produção de PRP-L usado na Unidade de Medicina Transfusional em AUSL-IRCCS di Reggio Emilia, Itália, e dispensação a pacientes com DED. Nosso objetivo é ajudar a comunidade científica a desenvolver métodos padrão de preparação, que possam aumentar a homogeneidade e a consistência em estudos e abordagens clínicas em todo o mundo.

Protocol

O PRP-L utilizado para a avaliação quantitativa dos fatores de crescimento foi coletado dentro de um estudo mais amplo sobre a caracterização de produtos PRP para fins regenerativos, realizado na AUSL-IRCCS di Reggio Emilia e aprovado pelo Comitê de Ética da Área Vasta Emilia Nord em 10 de janeiro de 2019 (número de protocolo 2019/0003319). Os doadores deram o seu consentimento esclarecido de acordo com a Declaração de Helsínquia. Nenhuma aprovação ética foi necessária para coletar os dados agregados e an?…

Representative Results

A justificativa para o uso de colírios derivados do soro (que é o produto à base de sangue mais frequentemente usado para o tratamento de doenças da superfície ocular) reside em seu conteúdo de GFs, que são quase completamente derivados de plaquetas circulantes. O PRP contém um número significativamente maior de plaquetas (e, consequentemente, de GFs derivados de plaquetas) em comparação com o soro do sangue periférico, variando entre 0,15 x 10 9-0,45 x 109 PLTs/mL. De acordo com as leis…

Discussion

Nos últimos anos, o uso clínico de produtos à base de plaquetas para patologias da superfície ocular tem aumentado, mas sua difusão é dificultada pela falta de robustez científica. Isso é causado principalmente pela ampla heterogeneidade nas fontes de doadores e nos protocolos de preparação, que muitas vezes não são totalmente divulgados ou não são projetados especificamente para o propósito para o qual são dispensados. Particularmente, ainda faltam informações sobre produtos à base de plaquetas coleta…

Materials

Equipments
CompoSeal Mobilea II	Fresenius Kabi, Germany		bag sealer
HeraSafe hood	Heraeus Instruments, Germany		Class II biohazard hood
MCS+ 9000 Mobile Platelet Collection System	Haemonetics, Italy		automated plasma and multicomponent collection equipment for donating platelet, red cell, plasma, or combination blood components
Platelet shaker, PF396i	Helmer, USA		Platelet shaker
Raycell X-ray Blood Irradiator	MDS Nordion, Canada		X-ray Blood Irradiator
ROTIXA 50RS	Hettich Zentrifugen, Germany		High speed entrifuge
Sysmex XS-1000i	Sysmex Europe GMBH, Germany		haemocytometer for platelet count
Warm bath, WB-M15	Falc Instruments, Italy		Warm bath
Materials
ACD-A anticoagulant solution A	Fenwal Inc., USA	DIN 00788139	anticoagulant solution for platelet apheresis (1000 ml)
BD BACTEC Peds Plus/F Culture vials	BD Biosciences, USA	BD 442020	Sterility assay
BD BACTEC Peds Plus/F Culture vials	BD Biosciences, USA	442020	At least 2 vials for sterility assay
BD Luer Lok Syringe	BD Plastipack, USA	300865	At least 4 sterile syringes (50 ml)
Bio-Plex Human Cancer Panel 1	BioRad Laboratories, USA	171AC500M	Standard panel for PDGF isoforms assessment
Bio-Plex Human Cancer Panel 2	BioRad Laboratories, USA	171AC600M	Standard panel for EGF assessment
Bio-Plex MAGPIX Multiplex Reader	BioRad Laboratories, USA	Magpix	This instrument allows multiple immunoassays using functionalized magnetic beads.
Bio-Plex Pro TGF-b Assay	BioRad Laboratories, USA	10024984	Set and standards for TGFb isoforms assessment
BioRet	ARIES s.r.l., Italy	A2DH0020	At least 4 piercing spike for blood bags
Blood collection tube	BD Vacutainer, USA	367835	1 tube, necessary to perform platelet counts
Eye drops kit. COL Medical Device for the application and preservation of eye drops from haemocomponents	Biomed Device s.r.l., Italy	COLC50	Eye drops kit. At least 2 kits for each PRP unit collected
Human Cancer PDGF-AB/BB Set 1x96well	BioRad Laboratories, USA	171BC511	Set for PDGF isoforms assessment
Human Cancer2 EGF Set 1x96well	BioRad Laboratories, USA	171BC603M	Set for EGF assessment
NaCl 0.9% sterile solution	Baxter S.p.A., Italy	B05BB01	1000 ml
OSDI Questionnaire	Allergan Inc., USA	OSDI	Ocular Surface Disease Index Questionnaire
Piercing spike	BioRet ARIES s.r.l., Italy	BS051004	Spike
Platelet Additive Solution A+ T-PAS+	TERUMO BCT Inc., Italy	40842	preservative solution for platelet concentrates (1000 ml)
Software Excel	Microsoft, USA	Excel	Data analysis software
Teruflex Transfer bag 1000 ml	TERUMO BCT Inc., Italy	BB*T100BM	1 for PRP dilution
Teruflex Transfer bag 300 ml	TERUMO BCT Inc., Italy	BB*030CM	At least 6 for each PRP unit collected