Trombocytrikt plasmalysat för behandling av ögonsjukdomar

Summary

Trombocytlysater representerar ett framväxande verktyg för behandling av okulära ytsjukdomar. Här föreslår vi en metod för beredning, dispensering, lagring och karakterisering av trombocytlysat som samlats in från blodplättsdonatorer.

Abstract

Olika okulära ytsjukdomar behandlas med blod-härledda ögondroppar. Deras användning har introducerats i klinisk praxis på grund av deras metabolit- och tillväxtfaktorinnehåll, vilket främjar regenerering av ögonytan. Blodbaserade ögondroppar kan framställas från olika källor (dvs. helblods- eller trombocytaferesdonation), liksom med olika protokoll (t.ex. olika utspädningar och frys-/upptiningscykler). Denna variabilitet hindrar standardiseringen av kliniska protokoll och följaktligen utvärderingen av deras kliniska effekt. Detaljerade och delade metodförfaranden kan bidra till att fastställa gemensamma riktlinjer. Under de senaste åren har allogena produkter spridit sig som ett alternativ till de autologa behandlingarna eftersom de garanterar högre effektstandarder; bland dem framställs de blodplättrika plasmalysatet (PRP-L) ögondropparna med enkla tillverkningsförfaranden. Vid enheten för transfusionsmedicin vid AUSL-IRCCS di Reggio Emilia, Italien, erhålls PRP-L från blodplätt-aferesdonation. Denna produkt späds initialt till 0,3 x 10 9 blodplättar/ml (med en genomsnittlig koncentration på 1 x 10 9 blodplättar/ml) i^0,9 % NaCl. Utspädda blodplättar fryses/tinas och centrifugeras därefter för att eliminera skräp. Den slutliga volymen delas upp i alikvoter på 1,45 ml och lagras vid −80 °C. Innan de dispenseras till patienter testas ögondroppar för sterilitet. Patienter kan lagra trombocytlysater vid −15 °C i upp till 1 månad. Tillväxtfaktorsammansättningen bedöms också utifrån slumpmässigt utvalda alikvoter, och medelvärdena rapporteras här.

Introduction

Blodderivat används ofta i sårvård¹, maxillofacial och ortopedisk kirurgi och för behandling av olika okulära ytsjukdomar² såsom torra ögonsjukdomar (DED)³. Vid DED försämras tårfilmens homeostas som en följd av onormal funktion hos olika faktorer som är involverade i tårproduktion och okulär ytintegritet ^4,5.

DED kännetecknas av heterogenitet i orsaker och svårighetsgrad ^6,7,8 och kan vara en följd av olika faktorer som åldrande, kön⁹, kontaktlinser^, aktuella eller systemiska läkemedel 10 eller redan existerande tillstånd som Sjögrens syndrom ¹⁰. Trots att de har milda symtom påverkar DED miljontals människor över hela världen, vilket påverkar deras livskvalitet och hälso- och sjukvårdssystemet också⁶.

Många behandlingar har rapporterats för denna patologi, men det finns fortfarande ingen överenskommelse om den mest effektiva lösningen¹². Hittills är konstgjorda tårar den första behandlingslinjen som syftar till att återställa tårfilmens vattenhaltiga sammansättning, om än dessa substitut inte innehåller de viktigaste biologiskt aktiva lösta ämnena av naturliga tårar ^6,11. Trombocytbaserade produkter anses vara ett giltigt alternativ^12,13 till konstgjorda tårar^, även om deras kliniska effekt, rekommendationer för användning och beredningsmetoder fortfarande är föremål för debatt³.

Blodbaserade produkter delar med tårar en liknande sammansättning när det gäller metaboliter¹⁴, proteiner, lipider, vitaminer, joner, tillväxtfaktorer (GF), antioxidantföreningar 11 och osmolaritet (300 mOsm / L)¹¹. Genom den synergistiska aktiviteten hos deras komponenter främjar de regenerering av hornhinneepitelet, hämmar frisättningen av inflammatoriska cytokiner och ökar antalet bägareceller och uttrycket av muciner i konjunktiva ^2,3.

Hittills har heterogenitet i oftalmiska blodbaserade produkter dokumenterats i litteraturen; Dessa produkter kan klassificeras enligt blodgivarnas ursprung, dvs. autologa eller allogena, liksom blodkällan, dvs. perifert blod, navelsträngsblod, serum eller blodplättar.

Även om autologa produkter var de mest utbredda³, blir allogena produkter nu det föredragna valet, eftersom de säkerställer högre effektivitets- och säkerhetsstandarder 15, tillsammans med en betydande minskning av kostnaderna^16,17. Tidigare studier visade faktiskt att blodbaserade produkter som erhållits från patienter med autoimmuna och/eller systemiska sjukdomar kan uppvisa förändrad kvalitet och funktionalitet 6,16,17. Trots det faktum att serumbaserade ögondroppar är de mest utbredda, blir trombocytbaserade produkter nyligen bekräftade som ett giltigt alternativ, eftersom de lätt kan förberedas samtidigt som de bibehåller signifikanta effektnivåer ^3,11. För närvarande tillgängliga trombocytbaserade produkter kan delas in i trombocytrik plasma (PRP), trombocytrikt plasmalysat (PRP-L) och plasmarikt på tillväxtfaktorer (PRGF)³.

Bland dem har PRP-L fördelen att vara en fryst produkt med lång livslängd. PRP-L kan framställas av aferes, buffy-coats eller till och med från utgående blodplättar (PLTs)^18,19, vilket på ett värdefullt sätt minskar deras slöseri. Alikvoterna kan lagras i månader i blodtransfusionscentra vid −80 °C eller till och med hemma hos patienter vid −15 °C under kortare perioder.

PRP-L är mycket berikade i GFs, som har visat sig stimulera ögonytans regenerering 12,20,21. Ändå finns det bara ett fåtal rapporterade kliniska studier på detta område, och alla använde autologa källor ^3,22. PRP-L behöver fortfarande ytterligare validering och karakterisering innan den rutinmässigt kan användas för behandling av ögonytesjukdomar, eftersom det inte finns några standardiserade riktlinjer för dess beredning, dispensering och lagring³.

Häri delas ett detaljerat protokoll för produktion av PRP-L som används vid transfusionsmedicinenheten i AUSL-IRCCS di Reggio Emilia, Italien, och dispensering till patienter med DED. Vi strävar efter att hjälpa det vetenskapliga samfundet att utveckla standardmetoder för beredning, vilket kan öka homogeniteten och konsistensen i världsomspännande studier och kliniska tillvägagångssätt.

Protocol

PRP-L som används för kvantitativ bedömning av tillväxtfaktorer samlades in i en bredare studie om karakterisering av PRP-produkter för regenerativa ändamål, utförd vid AUSL-IRCCS di Reggio Emilia och godkänd av Area Vasta Emilia Nord Ethical Committee den 10 januari 2019 (protokollnummer 2019/0003319). Givarna gav sitt informerade samtycke enligt Helsingforsdeklarationen. Inget etiskt godkännande var nödvändigt för att samla in aggregerade, anonyma data från frågeformuläret Ocular Surface Disease Index (…

Representative Results

Motivet för användningen av serumbaserade ögondroppar (som är den blodbaserade produkt som oftast används för behandling av ögonytesjukdomar) ligger i deras innehåll av GF, som nästan helt härrör från cirkulerande blodplättar. PRP innehåller ett signifikant högre antal blodplättar (och följaktligen av trombocyt-härledda GFs) jämfört med serum från perifert blod, mellan 0,15 x 10 9-0,45 x 109 PLTs/ml. Enligt italienska lagar bör antalet blodplättar i PRP-enheter vara minst 0,9 …

Discussion

Under de senaste åren har den kliniska användningen av trombocytbaserade produkter för okulära ytpatologier ökat, men deras diffusion hindras av bristen på vetenskaplig robusthet. Detta orsakas främst av stor heterogenitet i givarkällor och beredningsprotokoll, som ofta inte är fullständigt avslöjade eller inte specifikt utformade för det syfte för vilket de dispenseras. Särskilt saknas fortfarande information om trombocytbaserade produkter som samlats in av aferes. Syftet med detta arbete var därför att …

Materials

Equipments
CompoSeal Mobilea II	Fresenius Kabi, Germany		bag sealer
HeraSafe hood	Heraeus Instruments, Germany		Class II biohazard hood
MCS+ 9000 Mobile Platelet Collection System	Haemonetics, Italy		automated plasma and multicomponent collection equipment for donating platelet, red cell, plasma, or combination blood components
Platelet shaker, PF396i	Helmer, USA		Platelet shaker
Raycell X-ray Blood Irradiator	MDS Nordion, Canada		X-ray Blood Irradiator
ROTIXA 50RS	Hettich Zentrifugen, Germany		High speed entrifuge
Sysmex XS-1000i	Sysmex Europe GMBH, Germany		haemocytometer for platelet count
Warm bath, WB-M15	Falc Instruments, Italy		Warm bath
Materials
ACD-A anticoagulant solution A	Fenwal Inc., USA	DIN 00788139	anticoagulant solution for platelet apheresis (1000 ml)
BD BACTEC Peds Plus/F Culture vials	BD Biosciences, USA	BD 442020	Sterility assay
BD BACTEC Peds Plus/F Culture vials	BD Biosciences, USA	442020	At least 2 vials for sterility assay
BD Luer Lok Syringe	BD Plastipack, USA	300865	At least 4 sterile syringes (50 ml)
Bio-Plex Human Cancer Panel 1	BioRad Laboratories, USA	171AC500M	Standard panel for PDGF isoforms assessment
Bio-Plex Human Cancer Panel 2	BioRad Laboratories, USA	171AC600M	Standard panel for EGF assessment
Bio-Plex MAGPIX Multiplex Reader	BioRad Laboratories, USA	Magpix	This instrument allows multiple immunoassays using functionalized magnetic beads.
Bio-Plex Pro TGF-b Assay	BioRad Laboratories, USA	10024984	Set and standards for TGFb isoforms assessment
BioRet	ARIES s.r.l., Italy	A2DH0020	At least 4 piercing spike for blood bags
Blood collection tube	BD Vacutainer, USA	367835	1 tube, necessary to perform platelet counts
Eye drops kit. COL Medical Device for the application and preservation of eye drops from haemocomponents	Biomed Device s.r.l., Italy	COLC50	Eye drops kit. At least 2 kits for each PRP unit collected
Human Cancer PDGF-AB/BB Set 1x96well	BioRad Laboratories, USA	171BC511	Set for PDGF isoforms assessment
Human Cancer2 EGF Set 1x96well	BioRad Laboratories, USA	171BC603M	Set for EGF assessment
NaCl 0.9% sterile solution	Baxter S.p.A., Italy	B05BB01	1000 ml
OSDI Questionnaire	Allergan Inc., USA	OSDI	Ocular Surface Disease Index Questionnaire
Piercing spike	BioRet ARIES s.r.l., Italy	BS051004	Spike
Platelet Additive Solution A+ T-PAS+	TERUMO BCT Inc., Italy	40842	preservative solution for platelet concentrates (1000 ml)
Software Excel	Microsoft, USA	Excel	Data analysis software
Teruflex Transfer bag 1000 ml	TERUMO BCT Inc., Italy	BB*T100BM	1 for PRP dilution
Teruflex Transfer bag 300 ml	TERUMO BCT Inc., Italy	BB*030CM	At least 6 for each PRP unit collected