عزل وزراعة وتوصيف خلايا شوان الأولية والخلايا الكيراتينية والخلايا الليفية من القلفة البشرية
Summary
غالبا ما تتطلب دراسة التئام الجروح المرتبطة بالإصابة العضلية الهيكلية تقييم التفاعلات في المختبر بين خلايا شوان (SCs) والخلايا الكيراتينية والخلايا الليفية. يصف هذا البروتوكول عزل هذه الخلايا الأولية وزراعتها وتوصيف خصائصها من القلفة البشرية.
Abstract
يصف هذا البروتوكول طرق العزل ، وظروف الزراعة ، وتوصيف الخلايا الأولية البشرية ذات العائد العالي والجدوى باستخدام التفكك الأنزيمي السريع للبشرة. يتم حصاد الخلايا الكيراتينية الأولية والخلايا الليفية وخلايا شوان من القلفة البشرية حديثي الولادة، والتي تتوفر وفقا لإجراءات الرعاية القياسية. يتم تطهير الجلد الذي تمت إزالته ، ويتم إزالة الدهون والعضلات تحت الجلد باستخدام مشرط. تتكون الطريقة من الفصل الأنزيمي والميكانيكي لطبقات البشرة والجلد ، يليه هضم إنزيمي إضافي للحصول على معلقات أحادية الخلية من كل طبقة من طبقات الجلد هذه. وأخيرا، تزرع الخلايا المفردة في وسائط زراعة الخلايا المناسبة باتباع بروتوكولات زراعة الخلايا القياسية للحفاظ على النمو والبقاء على مدى أسابيع. معا ، يسمح هذا البروتوكول البسيط بعزل وزراعة وتوصيف جميع أنواع الخلايا الثلاثة من قطعة واحدة من الجلد لتقييم نماذج الجلد والأعصاب في المختبر . بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام هذه الخلايا معا في الثقافات المشتركة لقياس آثارها على بعضها البعض واستجاباتها للصدمة في المختبر في شكل خدوش يتم إجراؤها آليا في الثقافة المرتبطة بالتئام الجروح.
Introduction
الخلايا الأولية المشتقة من الأنسجة الحية والمستزرعة في ظل ظروف المختبر تشبه إلى حد كبير الحالة الفسيولوجية1 ، مما يجعلها نموذجا مثاليا للتحقيق في العمليات الفسيولوجية والفسيولوجية المرضية. يحتوي الجلد على أنواع متعددة من الخلايا ، بما في ذلك الخلايا الكيراتينية والخلايا الليفية والخلايا الخلوية والخلايا الصباغية وخلايا شوان (SCs) ، والتي يمكن عزلها وزراعتها لإجراء تجارب في المختبر. لم يتم وصف طرق عزل وزراعة الخلايا الكيراتينية والخلايا الليفية و SCs ، من قطعة واحدة من الجلد. الهدف من هذا البروتوكول ذو شقين: 1) إنشاء طريقة موثوقة وقابلة للتكرار لعزل وزراعة SCs الجلدية و 2) لاستخدام طريقة فعالة وقوية لعزل الخلايا الكيراتينية والخلايا الليفية و SCs من قلفة بشرية واحدة.
في الوقت الحاضر ، هناك بروتوكولات راسخة لعزل الخلايا الكيراتينية الجلدية2،3،4 والخلايا الليفية5،6. تصف هذه الدراسات عزل الخلايا الكيراتينية أو الخلايا الليفية أو كليهما عن الجلد ، ولكن لا يوجد بروتوكول يتناول كيفية إنشاء ثقافات SCs الأولية من جلد الإنسان. تشير الدراسات الحديثة إلى أن SCs العصبية تعدل العمليات الخلوية الكيراتينية والخلايا الليفية وتنظم الوظائف الفسيولوجية الطبيعية للجلد7. وبالتالي ، فإن SCs ضرورية لتوازن الجلد وتساهم بشكل كبير في تنظيم علم وظائف الأعضاء الذي يؤثر على سلوك أنواع خلايا الجلد المجاورة الموجودة8. لذلك ، فإن البروتوكول الذي يسمح بعزل كل نوع من أنواع الخلايا هذه مثالي للتجارب المختبرية التي تنطوي على اتصال بين الخلايا الخلوية أو التحدث المتبادل بين أنواع الخلايا.
يصف هذا البروتوكول إنشاء مزارع خلايا فردية للخلايا الأولية من قطعة واحدة من الجلد. هذا البروتوكول مفيد بشكل خاص عندما تكون كمية الأنسجة المتاحة محدودة. وعلاوة على ذلك، فإن عزل جميع أنواع الخلايا الثلاثة عن متبرع واحد يسمح بإجراء مقارنات قوية بين أنواع الخلايا أو تجارب الزراعة المشتركة مع التخفيف من تأثير علم الوراثة أثناء التجربة المطلوبة.
Protocol
Representative Results
Discussion
يصف هذا البروتوكول طريقة لعزل ثلاث مجموعات خلايا متميزة من قطعة واحدة من القلفة ، وهي الخلايا الكيراتينية والخلايا الليفية وخلايا شوان. هناك عدد قليل من بروتوكولات العزل المتاحة لعزل الخلايا الكيراتينية والخلايا الليفية2،3،5،6 <sup…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نشكر الدكتورة فادية كمال والدكتور رياض البربري على السماح لنا باستخدام الأدوات المخبرية والدعم الفني. تم دعم هذا العمل من خلال منح من المعاهد الوطنية للصحة (K08 AR060164-01A) ووزارة الدفاع (W81XWH-16-1-0725) إلى J. C. E. بالإضافة إلى الدعم المؤسسي من مركز هيرشي الطبي بجامعة ولاية بنسلفانيا.
Materials
| 0.22 µM sterile filters (Millex-GP Syringe Filter Unit,polyethersulfone) | MilliporeSigma | SLGPR33RS | |
| 70 µM cell strainers | CELLTREAT | 229483 | |
| 100 µM cell strainers | CELLTREAT | 229485 | |
| 1 mL disposable syringes | BD Luer-Lok | BD-309659 | |
| 5 mL disposable syringes (Syringe sterile, single use) | BD Luer-Lok | BD309646 | |
| 10 mL disposable syringes | BD Luer-Lok | BD305462 | |
| 1% TritonX-100 | Sigma | X100-1L | Prepared at the time of use |
| 4% paraformaldehyde solution | ThermoFisher Scientific | J19943.K2 | Ready to use and store at 4 °C |
| 5% BSA | Sigma | A7906-100G | Prepared at the time of use |
| 70% ethanol | Pharmco | 111000200 | |
| Antibiotic | ScienCell Research | 503 | |
| Chemometec Vial1-Cassette | Fisher Scientific | NC1420193 | |
| Collagenase | Gibco | 17018-029 | |
| Coverslip | Fisherbrand | 12544D 22*50-1.5 | |
| Dispase I | Sigma-Aldrich | D46693 | |
| DMEM basal medium | ScienCell Research | 9221 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline free from Ca2+ and Mg2+ (DPBS) | Corning | 21-031-CV) | |
| Nunc 15 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | ThermoFisher Scientific | 339651 | |
| Nunc 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | ThermoFisher Scientific | 339653 | |
| 1.5 mL micro-centrifuge tubes | Fisherbrand | 02-681-5 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | ThermoFisher Scientific | 10082147 | |
| Fibroblast complete medium | ScienCell Research | 2331 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11032 | Dilution (1:500) |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11008 | Dilution (1:500) |
| Hanks' Buffered Saline Solution (HBSS buffer) | Lonza | CC-5022 | |
| Human foreskin | De-identified human foreskin tissue for research purposes (Institutional Review Board- IRB #17574). | ||
| KGM-GOLD keratinocyte medium (KGM gold and supplements) | Lonza | 00192151 and 00192152 | |
| Mouse alpha-smooth muscle actin antibody | ThermoFisher Scientific | 14-9760-82 | Dilution (1:200) |
| Mouse Cytokeratin14 antibody | Abcam | ab7800 | Dilution (1:100) |
| Mouse S100 antibody | ThermoFisher Scientific | MA5-12969 | Dilution (1:200) |
| Multi chambered (4 well glass slide) | Tab-Tek | 154526 | |
| NucleoCounter -Via1-Cassette | Chemometec | 941-0012 | |
| Poly-L-Lysisne (PLL) | ScienCell Research | 32503 | |
| ProLong Gold Anti-fade Mountant with DAPI | Invitrogen | P36935 | |
| Rabbit K10 antibody | Sigma-Aldrich | SAB4501656 | Dilution (1:100) |
| Rabbit p75-NTR antibody | Millipore | AB1554 | Dilution (1:500) |
| Rabbit vimentin | ProteinTech | 10366-1-AP | Dilution (1:200) |
| Schwann cell culture medium | ScienCell Research | 1701 | |
| Precision tweezers DUMONT straight with extra fine tips Dumostar, 5 | ROTH | LH75.1 | Sterilize with 70% alcohol before use |
| IRIS Scissors, sharp/sharp. Length 4–3/8"(111mm) | Codman | 54-6500 | Sterilize with 70% alcohol before use |
| Sterilized surgical – sharp blade (Duro Edge Economy Single Edge Blades) | Razor blade company | 94-0120 | Sterilize with 70% alcohol before use |
| T25 culture flask | Corning | 353109 | |
| Trypsin neutralization buffer (TNS) | Lonza | CC-5002 | |
| Trypsin/EDTA | Lonza | CC-5012 | |
| Inverted microscope | ZEISS | Axio Observer 7- Axiocam 506 mono – Apotome.2 microscope | For immunofluorescence of chamber slide containing stained cells |
| Inverted microscope | ZEISS | Primovert | For visulaizing/observing cell attachment or detachment |
References
- Hawksworth, G. M. Advantages and disadvantages of using human cells for pharmacological and toxicological studies. Human & Experimental Toxicology. 13 (8), 568-573 (1994).
- Green, H., Kehinde, O., Thomas, J. Growth of cultured human epidermal cells into multiple epithelia suitable for grafting. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (11), 5665-5668 (1979).
- Fuchs, E., Green, H. Changes in keratin gene expression during terminal differentiation of the keratinocyte. Cell. 19 (4), 1033-1042 (1980).
- Aasen, T., Izpisua Belmonte, J. C. Isolation and cultivation of human keratinocytes from skin or plucked hair for the generation of induced pluripotent stem cells. Nature Protocols. 5 (2), 371-382 (2010).
- Seluanov, A., Vaidya, A., Gorbunova, V. Establishing primary adult fibroblast cultures from rodents. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (44), e2033 (2010).
- Belviso, I., et al. Isolation of adult human dermal fibroblasts from abdominal skin and generation of induced pluripotent stem cells using a non-integrating method. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (155), e60629 (2020).
- Silva, W. N., et al. Role of Schwann cells in cutaneous wound healing. Wound Repair and Regeneration. 26 (5), 392-397 (2018).
- Bray, E. R., Cheret, J., Yosipovitch, G., Paus, R. Schwann cells as underestimated, major players in human skin physiology and pathology. Experimental Dermatology. 29 (1), 93-101 (2020).
- Laverdet, B., et al. Skin innervation: important roles during normal and pathological cutaneous repair. Histology and Histopathology. 30 (8), 875-892 (2015).
- Jessen, K. R., Mirsky, R., Lloyd, A. C. Schwann cells: Development and role in nerve repair. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (7), 020487 (2015).
- Bentley, C. A., Lee, K. F. p75 is important for axon growth and Schwann cell migration during development. The Journal of Neuroscience. 20 (20), 7706-7715 (2000).
- Rutkowski, J. L., et al. Signals for proinflammatory cytokine secretion by human Schwann cells. Journal of Neuroimmunology. 101 (1), 47-60 (1999).
- Kumar, A., Brockes, J. P. Nerve dependence in tissue, organ, and appendage regeneration. Trends in Neurosciences. 35 (11), 691-699 (2012).
- Balakrishnan, A., et al. Insights into the role and potential of Schwann cells for peripheral nerve repair from studies of development and injury. Frontiers in Molecular Neuroscience. 13, 608442 (2020).
- Gresset, A., et al. Boundary caps give rise to neurogenic stem cells and terminal glia in the skin. Stem Cell Reports. 5 (2), 278-290 (2015).
- Stratton, J. A., et al. Purification and characterization of Schwann cells from adult human skin and nerve. eNeuro. 4 (3), (2017).
