Isolamento, coltura e caratterizzazione di cellule primarie di Schwann, cheratinociti e fibroblasti dal prepuzio umano
Summary
Lo studio della guarigione delle ferite associata a lesioni muscoloscheletriche richiede spesso la valutazione delle interazioni in vitro tra cellule di Schwann (SC), cheratinociti e fibroblasti. Questo protocollo descrive l’isolamento, la coltura e la caratterizzazione di queste cellule primarie dal prepuzio umano.
Abstract
Questo protocollo descrive i metodi di isolamento, le condizioni di coltura e la caratterizzazione delle cellule primarie umane con alta resa e vitalità utilizzando una rapida dissociazione enzimatica della pelle. I cheratinociti primari, i fibroblasti e le cellule di Schwann sono tutti raccolti dal prepuzio neonato umano, che è disponibile seguendo le procedure standard di cura. La pelle rimossa viene disinfettata e il grasso sottocutaneo e il muscolo vengono rimossi usando un bisturi. Il metodo consiste nella separazione enzimatica e meccanica degli strati epidermico e dermico, seguita da un’ulteriore digestione enzimatica per ottenere sospensioni unicellulari da ciascuno di questi strati cutanei. Infine, le singole cellule vengono coltivate in terreni di coltura cellulare appropriati seguendo protocolli di coltura cellulare standard per mantenere la crescita e la vitalità per settimane. Insieme, questo semplice protocollo consente l’isolamento, la coltivazione e la caratterizzazione di tutti e tre i tipi di cellule da un singolo pezzo di pelle per la valutazione in vitro di modelli pelle-nervo. Inoltre, queste cellule possono essere utilizzate insieme in co-colture per valutare i loro effetti l’una sull’altra e le loro risposte al trauma in vitro sotto forma di graffi eseguiti roboticamente nella coltura associata alla guarigione delle ferite.
Introduction
Le cellule primarie derivate da tessuto vivente e coltivate in condizioni in vitro assomigliano molto allo stato fisiologico1, rendendole un modello ideale per indagare i processi fisiologici e fisiopatologici. La pelle contiene più tipi di cellule, tra cui cheratinociti, fibroblasti, sebociti, melanociti e cellule di Schwann (SC), che possono essere isolate e coltivate per esperimenti in vitro . Non sono stati descritti metodi per isolare e coltivare cheratinociti, fibroblasti e SC, da un singolo pezzo di pelle. L’obiettivo di questo protocollo è duplice: 1) stabilire un metodo affidabile e riproducibile per l’isolamento e la coltura di SC dermiche e 2) utilizzare un metodo efficiente e robusto per l’isolamento di cheratinociti, fibroblasti e SC da un singolo prepuzio umano.
Attualmente esistono protocolli consolidati per isolare i cheratinociti cutanei 2,3,4 e i fibroblasti 5,6. Questi studi descrivono l’isolamento di cheratinociti, fibroblasti o entrambi dalla pelle, ma nessun protocollo affronta come stabilire colture di SC primarie dalla pelle umana. Studi recenti suggeriscono che le SC neuronali modulano i processi cellulari dei cheratinociti e dei fibroblasti e regolano le normali funzioni fisiologiche della pelle7. Le SC sono quindi fondamentali per l’omeostasi cutanea e contribuiscono in modo sostanziale alla fisiologia regolata che influenza il comportamento dei tipi di cellule cutanee vicinepresenti 8. Pertanto, un protocollo che consente l’isolamento di ciascuno di questi tipi di cellule è ideale per esperimenti in vitro che coinvolgono la comunicazione cellula-cellula o cross-talk tra tipi di cellule.
Questo protocollo descrive la creazione di singole colture cellulari di cellule primarie da un singolo pezzo di pelle. Questo protocollo è particolarmente utile quando la quantità di tessuto disponibile è limitata. Inoltre, l’isolamento di tutti e tre i tipi di cellule da un singolo donatore consente solidi confronti tra tipi di cellule o esperimenti di co-coltura, mitigando al contempo l’influenza della genetica durante l’esperimento desiderato.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo protocollo descrive un metodo per isolare tre distinte popolazioni cellulari da un singolo pezzo del prepuzio, vale a dire cheratinociti, fibroblasti e cellule di Schwann. Sono disponibili alcuni protocolli di isolamento per isolare cheratinociti e fibroblasti 2,3,5,6, ma nessuno descrive l’isolamento SC. Oltre alle cellule strutturali chiave della pelle, dei cheratinociti e dei fibrobla…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vorremmo ringraziare la Dott.ssa Fadia Kamal e la Dott.ssa Reyad Elbarbary per averci permesso di utilizzare strumenti di laboratorio e supporto tecnico. Questo lavoro è stato supportato da sovvenzioni del NIH (K08 AR060164-01A) e DOD (W81XWH-16-1-0725) a J. C. E. oltre al supporto istituzionale della Pennsylvania State University Hershey Medical Center.
Materials
| 0.22 µM sterile filters (Millex-GP Syringe Filter Unit,polyethersulfone) | MilliporeSigma | SLGPR33RS | |
| 70 µM cell strainers | CELLTREAT | 229483 | |
| 100 µM cell strainers | CELLTREAT | 229485 | |
| 1 mL disposable syringes | BD Luer-Lok | BD-309659 | |
| 5 mL disposable syringes (Syringe sterile, single use) | BD Luer-Lok | BD309646 | |
| 10 mL disposable syringes | BD Luer-Lok | BD305462 | |
| 1% TritonX-100 | Sigma | X100-1L | Prepared at the time of use |
| 4% paraformaldehyde solution | ThermoFisher Scientific | J19943.K2 | Ready to use and store at 4 °C |
| 5% BSA | Sigma | A7906-100G | Prepared at the time of use |
| 70% ethanol | Pharmco | 111000200 | |
| Antibiotic | ScienCell Research | 503 | |
| Chemometec Vial1-Cassette | Fisher Scientific | NC1420193 | |
| Collagenase | Gibco | 17018-029 | |
| Coverslip | Fisherbrand | 12544D 22*50-1.5 | |
| Dispase I | Sigma-Aldrich | D46693 | |
| DMEM basal medium | ScienCell Research | 9221 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline free from Ca2+ and Mg2+ (DPBS) | Corning | 21-031-CV) | |
| Nunc 15 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | ThermoFisher Scientific | 339651 | |
| Nunc 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | ThermoFisher Scientific | 339653 | |
| 1.5 mL micro-centrifuge tubes | Fisherbrand | 02-681-5 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | ThermoFisher Scientific | 10082147 | |
| Fibroblast complete medium | ScienCell Research | 2331 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11032 | Dilution (1:500) |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11008 | Dilution (1:500) |
| Hanks' Buffered Saline Solution (HBSS buffer) | Lonza | CC-5022 | |
| Human foreskin | De-identified human foreskin tissue for research purposes (Institutional Review Board- IRB #17574). | ||
| KGM-GOLD keratinocyte medium (KGM gold and supplements) | Lonza | 00192151 and 00192152 | |
| Mouse alpha-smooth muscle actin antibody | ThermoFisher Scientific | 14-9760-82 | Dilution (1:200) |
| Mouse Cytokeratin14 antibody | Abcam | ab7800 | Dilution (1:100) |
| Mouse S100 antibody | ThermoFisher Scientific | MA5-12969 | Dilution (1:200) |
| Multi chambered (4 well glass slide) | Tab-Tek | 154526 | |
| NucleoCounter -Via1-Cassette | Chemometec | 941-0012 | |
| Poly-L-Lysisne (PLL) | ScienCell Research | 32503 | |
| ProLong Gold Anti-fade Mountant with DAPI | Invitrogen | P36935 | |
| Rabbit K10 antibody | Sigma-Aldrich | SAB4501656 | Dilution (1:100) |
| Rabbit p75-NTR antibody | Millipore | AB1554 | Dilution (1:500) |
| Rabbit vimentin | ProteinTech | 10366-1-AP | Dilution (1:200) |
| Schwann cell culture medium | ScienCell Research | 1701 | |
| Precision tweezers DUMONT straight with extra fine tips Dumostar, 5 | ROTH | LH75.1 | Sterilize with 70% alcohol before use |
| IRIS Scissors, sharp/sharp. Length 4–3/8"(111mm) | Codman | 54-6500 | Sterilize with 70% alcohol before use |
| Sterilized surgical – sharp blade (Duro Edge Economy Single Edge Blades) | Razor blade company | 94-0120 | Sterilize with 70% alcohol before use |
| T25 culture flask | Corning | 353109 | |
| Trypsin neutralization buffer (TNS) | Lonza | CC-5002 | |
| Trypsin/EDTA | Lonza | CC-5012 | |
| Inverted microscope | ZEISS | Axio Observer 7- Axiocam 506 mono – Apotome.2 microscope | For immunofluorescence of chamber slide containing stained cells |
| Inverted microscope | ZEISS | Primovert | For visulaizing/observing cell attachment or detachment |
References
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