Summary

בידוד, תרבית ואפיון של תאי שוואן ראשוניים, קרטינוציטים ופיברובלסטים מעורלה אנושית

Published: March 23, 2022
doi:

Summary

המחקר של ריפוי פצעים הקשורים לפגיעה בשרירים-שלד דורש לעתים קרובות הערכה של אינטראקציות במבחנה בין תאי שוואן (SCs), קרטינוציטים ופיברובלסטים. פרוטוקול זה מתאר את הבידוד, התרבות והאפיון של תאים ראשוניים אלה מהעורלה האנושית.

Abstract

פרוטוקול זה מתאר שיטות בידוד, תנאי גידול ואפיון של תאים ראשוניים אנושיים בעלי תפוקה גבוהה וכדאיות באמצעות דיסוציאציה אנזימטית מהירה של העור. קרטינוציטים ראשוניים, פיברובלסטים ותאי שוואן נקטפים כולם מעורלת היילוד האנושית, הזמינה בהתאם להליכי הטיפול הסטנדרטיים. העור שהוסר מחוטא, והשומן והשרירים התת עוריים מוסרים באמצעות אזמל. השיטה מורכבת מהפרדה אנזימטית ומכנית של שכבות אפידרמיס ודרמליות, ואחריה עיכול אנזימטי נוסף לקבלת תרחיפים חד-תאיים מכל אחת משכבות העור הללו. לבסוף, תאים בודדים גדלים במדיה מתאימה של תרביות תאים בהתאם לפרוטוקולים סטנדרטיים של תרביות תאים כדי לשמור על גדילה וכדאיות במשך שבועות. יחד, פרוטוקול פשוט זה מאפשר בידוד, התרבות ואפיון של כל שלושת סוגי התאים מפיסת עור אחת לצורך הערכה חוץ גופית של מודלים של עור-עצבים. בנוסף, ניתן להשתמש בתאים אלה יחד בתרביות משותפות כדי לאמוד את השפעתם זה על זה ואת תגובותיהם לטראומה במבחנה בצורה של שריטות המבוצעות באופן רובוטי בתרבית הקשורה לריפוי פצעים.

Introduction

תאים ראשוניים שמקורם ברקמות חיות ובתרבית בתנאי מבחנה דומים מאוד למצב הפיזיולוגי1, מה שהופך אותם למודל אידיאלי לחקר תהליכים פיזיולוגיים ופתופיזיולוגיים. העור מכיל סוגי תאים מרובים, כולל קרטינוציטים, פיברובלסטים, סבוציטים, מלנוציטים ותאי שוואן (SCs), אותם ניתן לבודד ולתרבת אותם לניסויים במבחנה . שיטות לבידוד ותרבית קרטינוציטים, פיברובלסטים ו-SCs, מפיסת עור אחת, לא תוארו. מטרתו של פרוטוקול זה היא כפולה: 1) לבסס שיטה אמינה וניתנת לשחזור לבידוד וגידול של מעגלים עוריים ו-2) להשתמש בשיטה יעילה וחזקה לבידוד של קרטינוציטים, פיברובלסטים ו-SCs מעורלה אנושית אחת.

כיום, ישנם פרוטוקולים מבוססים לבידוד קרטינוציטים בעור 2,3,4 ופיברובלסטים 5,6. מחקרים אלה מתארים את הבידוד של קרטינוציטים, פיברובלסטים או שניהם מהעור, אך אין פרוטוקול המתייחס לאופן שבו ניתן ליצור תרביות של SCs ראשוניים מעור האדם. מחקרים אחרונים מצביעים על כך ש-SCs עצביים מווסתים תהליכים תאיים של קרטינוציטים ופיברובלסטים ומווסתים תפקודים פיזיולוגיים תקינים בעור7. לפיכך, SCs הם קריטיים להומאוסטזיס של העור ותורמים באופן משמעותי לפיזיולוגיה של הוויסות המשפיעה על התנהגותם של סוגי תאי עור שכנים הנמצאים8. לכן, פרוטוקול המאפשר בידוד של כל אחד מסוגי התאים הללו הוא אידיאלי לניסויים במבחנה הכוללים תקשורת בין תאים לתאים או לשיחה צולבת בין סוגי תאים.

פרוטוקול זה מתאר את הקמתן של תרביות תאים בודדות של תאים ראשוניים מפיסת עור אחת. פרוטוקול זה שימושי במיוחד כאשר כמות הרקמה הזמינה מוגבלת. יתר על כן, בידוד של כל שלושת סוגי התאים מתורם יחיד מאפשר השוואות חזקות בין סוגי תאים או ניסויים בתרבית משותפת תוך הפחתת השפעת הגנטיקה במהלך הניסוי הרצוי.

Protocol

רכישה ושימוש ברקמת עורלה אנושית לא מזוהה למטרות מחקר נבדקה וקיבלה את הקביעה של “מחקר לא אנושי” על ידי מועצת הביקורת המוסדית של המכללה לרפואה של פן סטייט (IRB #17574). הערה: על ידי ביצוע הפרוטוקול שלהלן, 2.4 x 106 קרטינוציטים, 4.4 x 106 פיברובלסטים ו 1.1 x 106 SCs מתקבלים מעורלה…

Representative Results

עורלה יילודית תקינה שימשה לבידוד של קרטינוציטים אפידרמליים ראשוניים ו-SCs עוריים ופיברובלסטים. התאים הראשוניים המבודדים עברו תרבית במדיה המתאימה של תרביות תאים שהכילו גורמי גדילה. לאחר זריעה של SCs ופיברובלסט בצלוחיות תרבית, רוב התאים דבקו בתחתית הבקבוקון תוך 2 שעות. במקרה של קרטינוציטים, ר…

Discussion

פרוטוקול זה מתאר שיטה לבודד שלוש אוכלוסיות תאים נפרדות מחתיכה אחת של העורלה, כלומר קרטינוציטים, פיברובלסטים ותאי שוואן. ישנם מספר פרוטוקולי בידוד זמינים לבידוד קרטינוציטים ופיברובלסטים 2,3,5,6, אך אף אחד מהם אינו מתאר בידוד SC.<sup class="xr…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

ברצוננו להודות לד”ר פאדיה כמאל ולד”ר ריאד אלברברי על שאפשרו לנו להשתמש במכשירי מעבדה ובתמיכה טכנית. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מה- NIH (K08 AR060164-01A) ו- DOD (W81XWH-16-1-0725) ל- J. C. E. בנוסף לתמיכה מוסדית מהמרכז הרפואי הרשי של אוניברסיטת פנסילבניה.

Materials

0.22 µM sterile filters (Millex-GP Syringe Filter Unit,polyethersulfone) MilliporeSigma SLGPR33RS
70 µM cell strainers CELLTREAT 229483
100 µM cell strainers CELLTREAT 229485
1 mL disposable syringes BD Luer-Lok BD-309659
5 mL disposable syringes (Syringe sterile, single use) BD Luer-Lok BD309646
10 mL disposable syringes BD Luer-Lok BD305462
1% TritonX-100 Sigma X100-1L Prepared at the time of use
4% paraformaldehyde solution ThermoFisher Scientific J19943.K2 Ready to use and store at 4 °C
5% BSA Sigma A7906-100G Prepared at the time of use
70% ethanol Pharmco 111000200
Antibiotic ScienCell Research 503
Chemometec Vial1-Cassette Fisher Scientific NC1420193
Collagenase Gibco 17018-029
Coverslip Fisherbrand 12544D 22*50-1.5
Dispase I Sigma-Aldrich D46693
DMEM basal medium ScienCell Research 9221
Dulbecco's phosphate-buffered saline free from Ca2+ and Mg2+ (DPBS) Corning  21-031-CV)
Nunc 15 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes ThermoFisher Scientific 339651
Nunc 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes ThermoFisher Scientific 339653
1.5 mL micro-centrifuge tubes Fisherbrand 02-681-5
Fetal bovine serum (FBS) ThermoFisher Scientific 10082147
Fibroblast complete medium ScienCell Research 2331
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 Invitrogen A11032 Dilution (1:500)
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 Invitrogen A11008 Dilution (1:500)
Hanks' Buffered Saline Solution (HBSS buffer) Lonza CC-5022
Human foreskin De-identified human foreskin tissue for research purposes (Institutional Review Board- IRB #17574).
KGM-GOLD keratinocyte medium (KGM gold and supplements) Lonza 00192151 and 00192152
Mouse alpha-smooth muscle actin antibody ThermoFisher Scientific 14-9760-82 Dilution (1:200)
Mouse Cytokeratin14 antibody Abcam ab7800 Dilution (1:100)
Mouse S100 antibody ThermoFisher Scientific MA5-12969 Dilution (1:200)
Multi chambered (4 well glass slide) Tab-Tek 154526
NucleoCounter -Via1-Cassette Chemometec 941-0012
Poly-L-Lysisne (PLL) ScienCell Research 32503
ProLong Gold Anti-fade Mountant with DAPI Invitrogen P36935
Rabbit K10 antibody Sigma-Aldrich SAB4501656 Dilution (1:100)
Rabbit p75-NTR antibody Millipore AB1554 Dilution (1:500)
Rabbit vimentin ProteinTech 10366-1-AP Dilution (1:200)
Schwann cell culture medium ScienCell Research 1701
Precision tweezers DUMONT straight with extra fine tips Dumostar, 5 ROTH LH75.1 Sterilize with 70% alcohol before use
IRIS Scissors, sharp/sharp. Length 4–3/8"(111mm) Codman 54-6500 Sterilize with 70% alcohol before use
Sterilized surgical – sharp blade (Duro Edge Economy Single Edge Blades) Razor blade company 94-0120 Sterilize with 70% alcohol before use
T25 culture flask Corning 353109
Trypsin neutralization buffer (TNS) Lonza CC-5002
Trypsin/EDTA Lonza CC-5012
Inverted microscope ZEISS Axio Observer 7- Axiocam 506 mono – Apotome.2 microscope For immunofluorescence of chamber slide containing stained cells
Inverted microscope ZEISS Primovert For visulaizing/observing cell attachment or detachment

References

  1. Hawksworth, G. M. Advantages and disadvantages of using human cells for pharmacological and toxicological studies. Human & Experimental Toxicology. 13 (8), 568-573 (1994).
  2. Green, H., Kehinde, O., Thomas, J. Growth of cultured human epidermal cells into multiple epithelia suitable for grafting. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (11), 5665-5668 (1979).
  3. Fuchs, E., Green, H. Changes in keratin gene expression during terminal differentiation of the keratinocyte. Cell. 19 (4), 1033-1042 (1980).
  4. Aasen, T., Izpisua Belmonte, J. C. Isolation and cultivation of human keratinocytes from skin or plucked hair for the generation of induced pluripotent stem cells. Nature Protocols. 5 (2), 371-382 (2010).
  5. Seluanov, A., Vaidya, A., Gorbunova, V. Establishing primary adult fibroblast cultures from rodents. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (44), e2033 (2010).
  6. Belviso, I., et al. Isolation of adult human dermal fibroblasts from abdominal skin and generation of induced pluripotent stem cells using a non-integrating method. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (155), e60629 (2020).
  7. Silva, W. N., et al. Role of Schwann cells in cutaneous wound healing. Wound Repair and Regeneration. 26 (5), 392-397 (2018).
  8. Bray, E. R., Cheret, J., Yosipovitch, G., Paus, R. Schwann cells as underestimated, major players in human skin physiology and pathology. Experimental Dermatology. 29 (1), 93-101 (2020).
  9. Laverdet, B., et al. Skin innervation: important roles during normal and pathological cutaneous repair. Histology and Histopathology. 30 (8), 875-892 (2015).
  10. Jessen, K. R., Mirsky, R., Lloyd, A. C. Schwann cells: Development and role in nerve repair. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (7), 020487 (2015).
  11. Bentley, C. A., Lee, K. F. p75 is important for axon growth and Schwann cell migration during development. The Journal of Neuroscience. 20 (20), 7706-7715 (2000).
  12. Rutkowski, J. L., et al. Signals for proinflammatory cytokine secretion by human Schwann cells. Journal of Neuroimmunology. 101 (1), 47-60 (1999).
  13. Kumar, A., Brockes, J. P. Nerve dependence in tissue, organ, and appendage regeneration. Trends in Neurosciences. 35 (11), 691-699 (2012).
  14. Balakrishnan, A., et al. Insights into the role and potential of Schwann cells for peripheral nerve repair from studies of development and injury. Frontiers in Molecular Neuroscience. 13, 608442 (2020).
  15. Gresset, A., et al. Boundary caps give rise to neurogenic stem cells and terminal glia in the skin. Stem Cell Reports. 5 (2), 278-290 (2015).
  16. Stratton, J. A., et al. Purification and characterization of Schwann cells from adult human skin and nerve. eNeuro. 4 (3), (2017).

Play Video

Cite This Article
Jagadeeshaprasad, M. G., Govindappa, P. K., Nelson, A. M., Elfar, J. C. Isolation, Culture, and Characterization of Primary Schwann Cells, Keratinocytes, and Fibroblasts from Human Foreskin. J. Vis. Exp. (181), e63776, doi:10.3791/63776 (2022).

View Video