ヒト包皮からの初代シュワン細胞、ケラチノサイト、および線維芽細胞の単離、培養、および特性評価
Summary
筋骨格損傷に関連する創傷治癒の研究は、しばしば、シュワン細胞(SC)、ケラチノサイト、および線維芽細胞間の インビトロ 相互作用の評価を必要とする。このプロトコルは、ヒト包皮からのこれらの初代細胞の単離、培養、および特性評価を記述している。
Abstract
このプロトコールは、皮膚の迅速な酵素解離を用いた高収率および生存率を有するヒト初代細胞の単離方法、培養条件、および特性評価を記載する。初代ケラチノサイト、線維芽細胞、およびシュワン細胞はすべて、ヒト新生児包皮から採取され、標準的なケア手順に従って入手可能である。除去された皮膚を消毒し、皮下の脂肪と筋肉をメスを用いて除去する。この方法は、表皮層および真皮層の酵素的および機械的分離、続いてこれらの表皮層のそれぞれから単一細胞懸濁液を得るためのさらなる酵素消化からなる。最後に、単一細胞を標準的な細胞培養プロトコルに従って適切な細胞培養培地中で増殖させ、数週間にわたって増殖および生存率を維持する。このシンプルなプロトコルを組み合わせることで、皮膚神経モデルの in vitro 評価のために、単一の皮膚から3つの細胞タイプすべてを単離、培養、および特性評価することができます。さらに、これらの細胞は、創傷治癒に関連する培養においてロボット的に行われる傷の形で、互いに対するそれらの効果および in vitro 外傷に対するそれらの応答を測定するために、共培養において一緒に使用することができる。
Introduction
生体組織由来の初代細胞を in vitro 条件下で培養すると、生理状態1によく似ており、生理学的・病態生理学的過程を調べるのに理想的なモデルとなっています。皮膚には、ケラチノサイト、線維芽細胞、皮脂細胞、メラノサイト、シュワン細胞(SC)を含む複数の細胞タイプが含まれており、 これらはインビトロ 実験のために単離および培養することができる。ケラチノサイト、線維芽細胞、およびSCを単一の皮膚片から単離および培養する方法は、記載されていない。このプロトコルの目標は、1)真皮SCの単離および培養のための信頼性が高く再現可能な方法を確立すること、および2)単一のヒト包皮からケラチノサイト、線維芽細胞、およびSCを単離するための効率的で堅牢な方法を使用することの2つである。
現在、皮膚ケラチノサイト2、3、4および線維芽細胞5,6を単離するための確立されたプロトコルがある。これらの研究は、皮膚からのケラチノサイト、線維芽細胞、またはその両方の単離を記述しているが、ヒト皮膚から初代SCの培養を確立する方法を扱うプロトコルはない。最近の研究は、ニューロンSCがケラチノサイトおよび線維芽細胞の細胞プロセスを調節し、正常な皮膚生理学的機能を調節することを示唆している7。したがって、SCは皮膚の恒常性に重要であり、隣接する皮膚細胞型の挙動に影響を与える生理機能を調節するのに実質的に寄与する8。したがって、これらの各細胞型の単離を可能にするプロトコルは、細胞間通信または細胞型間のクロストークを含むin vitro実験に理想的である。
このプロトコルは、単一の皮膚片からの初代細胞の個々の細胞培養物の確立を記述する。このプロトコールは、利用可能な組織の量が限られている場合に特に有用である。さらに、単一のドナーから3つの細胞型すべてを単離することで、所望の実験中の遺伝学の影響を軽減しながら、細胞型間の堅牢な比較または共培養実験が可能になります。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルは、包皮の単一片から3つの異なる細胞集団、すなわちケラチノサイト、線維芽細胞、およびシュワン細胞を単離する方法を記載する。ケラチノサイトおよび線維芽細胞2,3,5,6を単離するために利用可能な単離プロトコルはいくつかあるが、SC単離を記載するものはない。皮膚の重要…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ファディア・カマル博士とレイアド・エルバーバリ博士に、ラボ機器と技術サポートの使用を許可してくれたことに感謝します。この研究は、ペンシルベニア州立大学ハーシー医療センターからの制度的支援に加えて、NIH(K08 AR060164-01A)およびDOD(W81XWH-16-1-0725)からJ. C. E.への助成金によって支援されました。
Materials
| 0.22 µM sterile filters (Millex-GP Syringe Filter Unit,polyethersulfone) | MilliporeSigma | SLGPR33RS | |
| 70 µM cell strainers | CELLTREAT | 229483 | |
| 100 µM cell strainers | CELLTREAT | 229485 | |
| 1 mL disposable syringes | BD Luer-Lok | BD-309659 | |
| 5 mL disposable syringes (Syringe sterile, single use) | BD Luer-Lok | BD309646 | |
| 10 mL disposable syringes | BD Luer-Lok | BD305462 | |
| 1% TritonX-100 | Sigma | X100-1L | Prepared at the time of use |
| 4% paraformaldehyde solution | ThermoFisher Scientific | J19943.K2 | Ready to use and store at 4 °C |
| 5% BSA | Sigma | A7906-100G | Prepared at the time of use |
| 70% ethanol | Pharmco | 111000200 | |
| Antibiotic | ScienCell Research | 503 | |
| Chemometec Vial1-Cassette | Fisher Scientific | NC1420193 | |
| Collagenase | Gibco | 17018-029 | |
| Coverslip | Fisherbrand | 12544D 22*50-1.5 | |
| Dispase I | Sigma-Aldrich | D46693 | |
| DMEM basal medium | ScienCell Research | 9221 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline free from Ca2+ and Mg2+ (DPBS) | Corning | 21-031-CV) | |
| Nunc 15 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | ThermoFisher Scientific | 339651 | |
| Nunc 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | ThermoFisher Scientific | 339653 | |
| 1.5 mL micro-centrifuge tubes | Fisherbrand | 02-681-5 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | ThermoFisher Scientific | 10082147 | |
| Fibroblast complete medium | ScienCell Research | 2331 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11032 | Dilution (1:500) |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11008 | Dilution (1:500) |
| Hanks' Buffered Saline Solution (HBSS buffer) | Lonza | CC-5022 | |
| Human foreskin | De-identified human foreskin tissue for research purposes (Institutional Review Board- IRB #17574). | ||
| KGM-GOLD keratinocyte medium (KGM gold and supplements) | Lonza | 00192151 and 00192152 | |
| Mouse alpha-smooth muscle actin antibody | ThermoFisher Scientific | 14-9760-82 | Dilution (1:200) |
| Mouse Cytokeratin14 antibody | Abcam | ab7800 | Dilution (1:100) |
| Mouse S100 antibody | ThermoFisher Scientific | MA5-12969 | Dilution (1:200) |
| Multi chambered (4 well glass slide) | Tab-Tek | 154526 | |
| NucleoCounter -Via1-Cassette | Chemometec | 941-0012 | |
| Poly-L-Lysisne (PLL) | ScienCell Research | 32503 | |
| ProLong Gold Anti-fade Mountant with DAPI | Invitrogen | P36935 | |
| Rabbit K10 antibody | Sigma-Aldrich | SAB4501656 | Dilution (1:100) |
| Rabbit p75-NTR antibody | Millipore | AB1554 | Dilution (1:500) |
| Rabbit vimentin | ProteinTech | 10366-1-AP | Dilution (1:200) |
| Schwann cell culture medium | ScienCell Research | 1701 | |
| Precision tweezers DUMONT straight with extra fine tips Dumostar, 5 | ROTH | LH75.1 | Sterilize with 70% alcohol before use |
| IRIS Scissors, sharp/sharp. Length 4–3/8"(111mm) | Codman | 54-6500 | Sterilize with 70% alcohol before use |
| Sterilized surgical – sharp blade (Duro Edge Economy Single Edge Blades) | Razor blade company | 94-0120 | Sterilize with 70% alcohol before use |
| T25 culture flask | Corning | 353109 | |
| Trypsin neutralization buffer (TNS) | Lonza | CC-5002 | |
| Trypsin/EDTA | Lonza | CC-5012 | |
| Inverted microscope | ZEISS | Axio Observer 7- Axiocam 506 mono – Apotome.2 microscope | For immunofluorescence of chamber slide containing stained cells |
| Inverted microscope | ZEISS | Primovert | For visulaizing/observing cell attachment or detachment |
References
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