Onderzoek naar het effect van pesticiden op Caenorhabditis elegans Neuronen
Summary
Jongvolwassen Caenorhabditis elegans-nematoden worden gedurende 2-24 uur blootgesteld aan verschillende concentraties commerciële pesticiden of andere toxische stoffen. Vervolgens kunnen verschillende neuronen worden gevisualiseerd met behulp van fluorescerende spanningen. Dit artikel laat zien hoe nematoden kunnen worden blootgesteld aan pesticiden en neuronschade kan worden beoordeeld.
Abstract
Caenorhabditis elegans is een krachtig modelorganisme dat in veel onderzoekslaboratoria wordt gebruikt om de gevolgen van blootstelling aan chemische verontreinigende stoffen, pesticiden en een breed scala aan giftige stoffen te begrijpen. Deze nematoden zijn gemakkelijk om mee te werken en kunnen worden gebruikt om nieuwe onderzoeksresultaten te genereren, zelfs in het niet-gegradueerde biologielaboratorium. Een meerweekse laboratoriumreeks van authentieke, studentgestuurde onderzoeksprojecten traint studenten in een toolkit van technieken en benaderingen in gedragsmetingen, celbiologie en microscopie die ze vervolgens toepassen op hun projecten. Een techniek in die toolkit is het kwantificeren van het percentage neuronen dat neurodegeneratieve schade vertoont na blootstelling aan een chemisch toxisch middel zoals een pesticide. Jongvolwassen C. elegans-nematoden kunnen gedurende 2-24 uur worden blootgesteld aan verschillende concentraties van in de handel verkrijgbare pesticiden of andere soorten toxische stoffen. Vervolgens kunnen niet-gegradueerde studenten verschillende neuronsubtypen visualiseren met behulp van fluorescerende stammen van C. elegans. Deze technieken vereisen geen geavanceerde beeldverwerkingssoftware en zijn effectief bij zelfs lage vergrotingen, waardoor de noodzaak van dure confocale microscopie overbodig is. Dit artikel laat zien hoe de nematoden met pesticiden kunnen worden behandeld en hoe de neuronen in beeld kunnen worden gebracht en gescoord. Het biedt ook een eenvoudig protocol voor de microscopie en analyse van neuronmorfologie. De materialen die voor deze techniek worden gebruikt, zijn goedkoop en gemakkelijk beschikbaar in de meeste niet-gegradueerde biologieafdelingen. Deze techniek kan worden gecombineerd met gedragsmaatregelen zoals voortbeweging, basale vertraging of het leggen van eieren om een potentieel publiceerbare reeks experimenten uit te voeren en niet-gegradueerde studenten een authentieke onderzoekservaring te bieden tegen zeer lage kosten.
Introduction
Caenorhabditis elegans is een uitstekend modelorganisme voor laboratoriumcursussen in biologische wetenschappencursussen voor studenten op inleidend en middelhoog niveau. Deze laboratoriumprocedure kan worden gebruikt als onderdeel van een module van meerdere weken die verschillende effecten van veelgebruikte pesticiden op het gedrag van C. elegans en celbiologie onderzoekt. Studenten kunnen leren hoe ze onafhankelijke projecten kunnen ontwerpen en uitvoeren die hen data-analyse en presentatievaardigheden leren. Dit artikel richt zich op de protocollen voor het blootstellen van C. elegans aan pesticidenmengsels en vervolgens het observeren en analyseren van de effecten op de morfologie van neuronen.
Gazon chemische pesticide mengsels worden veel gebruikt voor residentieel en agrarisch gebruik en kunnen worden gekocht bij elke lokale tuinwinkel. Er is toenemende bezorgdheid over de veiligheid van deze chemicaliën voor mens en dier 1,2,3. Studenten kunnen de wetenschappelijke literatuur lezen en een pesticide selecteren voor experimentele evaluatie en zo meer te weten komen over basisbiologie en neurobiologie, evenals belangrijke laboratoriumvaardigheden zoals experimenteel ontwerp en analyse, en algemene laboratoriumvaardigheden zoals pipetteren en seriële verdunningen, ontleden van microscopie, fluorescerende microscopie, digitale fotografie en figuurproductie.
De protocollen die in dit artikel worden beschreven, kunnen op zichzelf staan in een cursus op gemiddeld niveau in biologie of neurowetenschappen of deel uitmaken van een module van meerdere weken die ook metingen van gedrag kan omvatten dat wordt bestuurd door bepaalde groepen neuronen. In dit protocol wordt bijvoorbeeld een beoordeling beschreven van de morfologie van cholinerge neuronen die de voortbeweging regelen met behulp van een stam van nematode die GFP (LX 929) tot expressie brengt in cholinerge neuronen4. Deze stammen zijn voor zeer lage prijzen verkrijgbaar bij het Caenorhabditis elegans Genetics Center (https://cgc.umn.edu/). Stammen die GFP tot expressie brengen in dopaminerge neuronen (OH 7457), cholinerge neuronen (LX 929) of mCherry uitgedrukt in alle neuronen (PVX4) zijn allemaal goede keuzes. Studenten konden ook de voortbeweging meten en gegevens verkrijgen om de beoordeling van morfologie te begeleiden. Een volledige beschrijving van een meerweeks studentengroepproject is te vinden in Susman5.
Dit studentengroepproject is vrij goedkoop en eenvoudig op te zetten voor groepen van vier studenten. De benodigde materialen omvatten een ontleedmicroscoop, toegang tot een fluorescentie samengestelde microscoop met een aangesloten digitale camera, petriplaten en toegang tot nematodegroeiagar, groeibeperkte bacteriën (stam OP50, van de CGC), een gasvlam Bunsen-brander of een alcohollamp, een autoclaaf, platinadraad en algemene laboratoriumbenodigdheden zoals micropipetters, microscoopglaasjes, coverslips en glazen Pasteur pipetten. Afhankelijk van de chemische stof die door de studentengroepen wordt onderzocht, moeten de stappen in het protocol mogelijk onder een zuurkast of met handschoenen worden uitgevoerd. Dit protocol maakt gebruik van chemische mengsels die in water oplosbaar (niet vluchtig) zijn en alle veilige hanteringsprocedures die door de fabrikant worden aanbevolen, worden gevolgd.
Protocol
Representative Results
Discussion
De protocollen die in dit manuscript worden beschreven, werken met succes alleen of als onderdeel van een meerweeks onafhankelijk studentengroepproject. De protocollen zijn ook vatbaar voor stand-alone, een week verkennende ervaringen. De aaltjestammen zijn goedkoop en gemakkelijk te onderhouden in het onderzoekslaboratorium. Studenten kunnen gemakkelijk leren hoe ze wormen kunnen plukken met een wormenpluk of hoe ze ze kunnen verplaatsen door platen met water te spoelen en ze door de zwaartekracht te laten bezinken. De …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Het werk dat in dit manuscript wordt beschreven, is gedaan voor een klas op gemiddeld niveau in de neurowetenschappen. Fondsen voor de reagentia en benodigdheden werden verstrekt door de afdeling Biologie aan het Vassar College. De microscopen en het digitale beeldvormingssysteem werden ook geleverd door de afdeling Biologie van het Vassar College. De auteur bedankt alle vele studenten die deze cursus hebben gevolgd.
Materials
| Agar | Fisher Scientific | BP97445 | |
| Agarose | Fisher Scientific | MP1AGAH0250 | |
| Alcohol lamp | Fisher Scientific | 17012826 | |
| Bunsen burner | Fisher Scientific | 17-012-820 | |
| C. elegans strains | C. elegans Genetics Center | ||
| CaCl | Fisher Scientific | 10035-04-8 | |
| Cholesterol | Fisher Scientific | AAA1147030 | |
| Coverslips | Fisher Scientific | 12-545-AP | |
| Digital camera | Nikon | These can vary depending on the requirement | |
| Dissecting scope | Nikon | SMZ745 | |
| E. coli strain (OP50) | C. elegans Genetics Center | ||
| Ethanol | Fisher Scientific | BP2818100 | |
| Fluorescent scope | Nikon | These can vary depending on the requirement | |
| Imaging software | Nikon | These can vary depending on the requirement | |
| Inoculation loop | Fisher Scientific | 131045 | |
| LB Broth Base | Fisher Scientific | BP9723-500 | |
| MgSO4 | Fisher Scientific | 10034-99-8 | |
| Microfuge tubes | Fisher Scientific | 05408129 | |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 22-265446 | |
| Pasteur pipets | Fisher Scientific | 13-678-20A | |
| Petri dishes | Fisher Scientific | AS4050 | |
| Pipette tips | Fisher Scientific | 94060316 | |
| Pipetters | Fisher Scientific | 14-386-319 | |
| Platinum wire | Genesee Scientific | 59-1M30P | |
| Potassium Phosphate buffer | Fisher Scientific | AAJ61413AP | |
| Sodium azide | Fisher Scientific | AC447810250 |
References
- Duzguner, V., Erdogan, S. Chronic exposure to imidacloprid induces inflammation and oxidative stress in the liver & central nervous system of rats. Pesticide Biochemistry and Physiology. 104 (1), 58-64 (2012).
- Catae, A. F., et al. Exposure to a sublethal concentration of imidacloprid and the side effects on target and nontarget organs of Apis mellifera (Hymenoptera, Apidae). Ecotoxicology. 27 (2), 109-121 (2018).
- Bradford, B. R., Whidden, E., Gervasio, E. D., Checchi, P. M., Raley-Susman, K. M. Neonicotinoid-containing insecticide disruption of growth, locomotion, and fertility in Caenorhabditis elegans. PLOS One. 15 (9), 0238637 (2020).
- Jospin, M., et al. A neuronal acetylcholine receptor regulates the balance of muscle excitation and inhibition in Caenorhabditis elegans. PLoS Biology. 7 (12), 1000265 (2009).
- Susman, K. . Discovery-Based Learning in the Life Sciences. , (2015).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , (2006).
- Brody, H. A., Chou, E., Gray, J. M., Pokyrwka, N. J., Raley-Susman, K. M. Mancozeb-induced behavioral deficits precede structural neural degeneration. NeuroToxicology. 34, 74-81 (2013).
- Chen, P., Martinez-Finley, E. J., Bornhorst, J., Chakraborty, S., Aschner, M. Metal-induced neurodegeneration in C. elegans. Frontiers in Aging Neuroscience. 5, (2013).
- Hart, A. Behavior. WormBook. , (2006).
- Harlow, P. H., et al. The nematode Caenorhabditis elegans as a tool to predict chemical activity on mammalian development and identify mechanisms influencing toxicological outcome. Scientific Reports. 6 (1), 22965 (2016).
