Examinando o efeito dos pesticidas em Caenorhabditis elegans Neurônios
Summary
Os nematoides de caenorhabditis para jovens adultos são expostos a diferentes concentrações de pesticidas comerciais ou outros tóxicos por 2-24 h. Em seguida, diferentes neurônios podem ser visualizados usando cepas fluorescentes. Este artigo demonstra como expor nematoides a pesticidas e avaliar danos aos neurônios.
Abstract
Caenorhabditis elegans é um poderoso organismo modelo usado em muitos laboratórios de pesquisa para entender as consequências da exposição a poluentes químicos, pesticidas e uma grande variedade de substâncias tóxicas. Esses nematoides são fáceis de trabalhar e podem ser usados para gerar novos achados de pesquisa, mesmo no laboratório de biologia da graduação. Uma série de laboratórios de vários dias de projetos de pesquisa autênticos e orientados por estudantes treina os alunos em um kit de ferramentas de técnicas e abordagens em medidas comportamentais, biologia celular e microscopia que eles então aplicam em seus projetos. Uma técnica nesse kit de ferramentas é quantificar a porcentagem de neurônios que exibem danos neurodegenerativos após a exposição a um toxicante químico como um pesticida. Nematoides jovens adultos C. elegans podem ser expostos a diferentes concentrações de pesticidas disponíveis comercialmente ou outros tipos de tóxicos por 2-24 h. Em seguida, os estudantes de graduação podem visualizar diferentes subtipos de neurônios usando cepas fluorescentes de C. elegans. Essas técnicas não exigem software sofisticado de processamento de imagem e são eficazes até mesmo em baixas ampliações, tornando desnecessária a necessidade de microscopia confocal cara. Este artigo demonstra como tratar os nematoides com pesticidas e como imaginar e pontuar os neurônios. Também fornece um protocolo simples para a microscopia e análise da morfologia do neurônio. Os materiais utilizados para esta técnica são baratos e prontamente disponíveis na maioria dos departamentos de biologia de graduação. Essa técnica pode ser combinada com medidas comportamentais como locomoção, desaceleração basal ou colocação de ovos para realizar uma série potencialmente publicável de experimentos e dar aos estudantes de graduação uma experiência de pesquisa autêntica a um custo muito baixo.
Introduction
Caenorhabditis elegans é um excelente organismo modelo para formação de cursos laboratoriais em cursos de ciências biológicas para alunos de nível introdutório e intermediário. Este procedimento laboratorial pode ser usado como parte de um módulo de várias semanas que explora vários efeitos de pesticidas comumente usados no comportamento de C. elegans e biologia celular. Os alunos podem aprender a projetar e realizar projetos independentes que lhes ensinam habilidades de análise de dados e apresentação. Este artigo se concentra nos protocolos para expor C. elegans a misturas de pesticidas e, em seguida, observar e analisar os efeitos sobre a morfologia do neurônio.
Misturas de pesticidas químicos de gramado são amplamente utilizadas para uso residencial e agrícola e podem ser compradas em qualquer loja de jardim local. Há uma preocupação crescente com a segurança desses produtos químicos para humanos e vida selvagem 1,2,3. Os alunos podem ler a literatura científica e selecionar um pesticida para avaliação experimental e, ao fazê-lo, podem aprender sobre biologia básica e neurobiologia, bem como importantes habilidades laboratoriais, como design e análise experimental, e habilidades gerais de laboratório como pipetação e diluições seriais, microscopia dissecando, microscopia fluorescente, fotografia digital e produção de figuras.
Os protocolos descritos neste artigo podem ficar sozinhos em um curso de nível intermediário em biologia ou neurociência ou fazer parte de um módulo de várias semanas que também poderia incluir medições de comportamentos regidos por determinados grupos de neurônios. Por exemplo, descrito neste protocolo é uma avaliação da morfologia dos neurônios colinérgicos que governam a locomoção usando uma cepa de nematoide que expressa GFP (LX 929) em neurônios colinérgicos4. Essas cepas podem ser obtidas por preços muito baixos do Centro de Genética De Caenorhabditis Elegans (https://cgc.umn.edu/). Cepas expressas GFP em neurônios dopaminérgicos (OH 7457), neurônios colinérgicos (LX 929) ou mCherry expressos em todos os neurônios (PVX4) são todas boas escolhas. Os alunos também poderiam medir a locomoção e obter dados para acompanhar a avaliação da morfologia. Uma descrição completa de um projeto de grupo estudantil de várias semanas pode ser encontrada em Susman5.
Este projeto de grupo estudantil é bastante barato e fácil de configurar para grupos de quatro alunos. Os materiais necessários incluem um microscópio dissecando, acesso a um microscópio composto de fluorescência que pode ter uma câmera digital anexada, placas de Petri e acesso a ágar de crescimento de nematoide, bactérias limitadas ao crescimento (cepa OP50, do CGC), um queimador bunsen de chama de gás ou uma lâmpada de álcool, uma autoclave, fio de platina e suprimentos de laboratório gerais como micropipetters, slides de microscópio, tampas, e pipetas pasteur de vidro. Dependendo do toxicante químico que está sendo examinado pelos grupos estudantis, as etapas do protocolo podem precisar ocorrer sob um capuz de fumaça ou com luvas. Este protocolo utiliza misturas químicas solúveis em água (não voláteis), e todos os procedimentos de manuseio seguro recomendados pelo fabricante são seguidos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Os protocolos descritos neste manuscrito funcionam sozinhos ou como parte de um projeto de grupo estudantil independente de várias semanas. Os protocolos também são favoráveis a experiências exploratórias autônomas de uma semana. As cepas de nematoide são baratas e fáceis de manter no laboratório de pesquisa. Os alunos podem prontamente aprender a escolher vermes com uma picareta de vermes ou como movê-los lavando placas com água e permitindo que eles se instalem pela gravidade. Os experimentos podem ser real…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
O trabalho descrito neste manuscrito foi feito para uma classe de nível intermediário em neurociência. Os recursos para os reagentes e suprimentos foram fornecidos pelo Departamento de Biologia da Faculdade Vassar. Os microscópios e o sistema de imagem digital também foram fornecidos pelo Departamento de Biologia da Faculdade Vassar. O autor agradece a todos os muitos alunos que fizeram este curso.
Materials
| Agar | Fisher Scientific | BP97445 | |
| Agarose | Fisher Scientific | MP1AGAH0250 | |
| Alcohol lamp | Fisher Scientific | 17012826 | |
| Bunsen burner | Fisher Scientific | 17-012-820 | |
| C. elegans strains | C. elegans Genetics Center | ||
| CaCl | Fisher Scientific | 10035-04-8 | |
| Cholesterol | Fisher Scientific | AAA1147030 | |
| Coverslips | Fisher Scientific | 12-545-AP | |
| Digital camera | Nikon | These can vary depending on the requirement | |
| Dissecting scope | Nikon | SMZ745 | |
| E. coli strain (OP50) | C. elegans Genetics Center | ||
| Ethanol | Fisher Scientific | BP2818100 | |
| Fluorescent scope | Nikon | These can vary depending on the requirement | |
| Imaging software | Nikon | These can vary depending on the requirement | |
| Inoculation loop | Fisher Scientific | 131045 | |
| LB Broth Base | Fisher Scientific | BP9723-500 | |
| MgSO4 | Fisher Scientific | 10034-99-8 | |
| Microfuge tubes | Fisher Scientific | 05408129 | |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 22-265446 | |
| Pasteur pipets | Fisher Scientific | 13-678-20A | |
| Petri dishes | Fisher Scientific | AS4050 | |
| Pipette tips | Fisher Scientific | 94060316 | |
| Pipetters | Fisher Scientific | 14-386-319 | |
| Platinum wire | Genesee Scientific | 59-1M30P | |
| Potassium Phosphate buffer | Fisher Scientific | AAJ61413AP | |
| Sodium azide | Fisher Scientific | AC447810250 |
References
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