カエノルハブディティス・エレガンス神経細胞に対する農薬の効果の検討
Summary
若年成人 のCaenorhabditis elegans 線虫は、異なる濃度の市販の農薬または他の毒性物質に2〜24時間曝露される。次いで、蛍光発現株を用いて異なるニューロンを視覚化することができる。この論文は、線虫を農薬にさらし、ニューロンの損傷を評価する方法を実証する。
Abstract
Caenorhabditis elegans は、化学汚染物質、農薬、および多種多様な有毒物質への曝露の結果を理解するために多くの研究所で使用される強力なモデル生物である。これらの線虫は扱いやすく、学部の生物学研究室でも新しい研究成果を生み出すために使用できます。数週間にわたる本格的な学生主導の研究プロジェクトのラボシリーズは、行動測定、細胞生物学、顕微鏡検査の技術とアプローチのツールキットを学生に訓練し、プロジェクトに適用します。そのツールキットの1つの技術は、農薬のような化学毒性物質にさらされた後に神経変性損傷を示すニューロンの割合を定量化することです。若年成人 のC. elegans 線虫は、市販の農薬または他のタイプの毒性物質の異なる濃度に2〜24時間曝露され得る。その後、学部生は、蛍光発現株の C. elegansを用いて、異なるニューロンサブタイプを視覚化することができる。これらの技術は、高度な画像処理ソフトウェアを必要とせず、低倍率でも有効であるため、高価な共焦点顕微鏡の必要性が不要である。この論文は、線虫を農薬で処理する方法と、ニューロンを画像化してスコアリングする方法を示しています。また、ニューロン形態の顕微鏡検査および分析のための簡単なプロトコルも提供します。この技術に使用される材料は安価で、ほとんどの学部生物学部門で容易に入手可能です。このテクニックは、移動、基礎減速、産卵などの行動尺度と組み合わせて、潜在的に公開可能な一連の実験を行い、学部生に非常に低コストで本物の研究体験を提供することができます。
Introduction
Caenorhabditis elegans は、入門および中級レベルの学生のための生物科学コースの実験室コーストレーニングのための優れたモデル生物です。この実験室手順は、 C. elegans の行動および細胞生物学に対する一般的に使用される農薬の様々な影響を探求する数週間のモジュールの一部として使用することができる。学生は、データ分析とプレゼンテーションのスキルを教える独立したプロジェクトを設計して実行する方法を学ぶことができます。本稿では、 C. elegans を農薬混合物に曝露し、ニューロン形態への影響を観察および分析するためのプロトコルに焦点を当てる。
芝生の化学農薬混合物は、住宅用および農業用として広く使用されており、地元のガーデンストアで購入できます。人間や野生生物に対するこれらの化学物質の安全性に対する懸念が高まっています1,2,3。学生は科学文献を読み、実験評価のために農薬を選択することができ、そうすることで、基本的な生物学と神経生物学、実験設計や分析などの重要な実験室スキル、ピペッティングや連続希釈、解剖顕微鏡、蛍光顕微鏡、デジタル写真、フィギュア制作などの一般的なラボスキルを学ぶことができます。
この論文で説明するプロトコルは、生物学または神経科学の中級レベルのコースで単独で立つことも、特定のニューロングループによって支配される行動の測定を含む複数週のモジュールの一部にすることもできます。例えば、このプロトコールに記載されているのは、コリン作動性ニューロン4においてGFP(LX 929)を発現する線虫の株を用いた移動運動を支配するコリン作動性ニューロンの形態の評価である。これらの株は、 Caenorhabditis elegans Genetics Center(https://cgc.umn.edu/)から非常に低価格で入手できます。ドーパミン作動性ニューロン(OH 7457)、コリン作動性ニューロン(LX 929)、またはすべてのニューロンで発現されるmCherry(PVX4)においてGFPを発現する株はすべて良い選択である。学生はまた、移動を測定し、形態学の評価に付随するデータを取得することもできます。複数週間の学生グループプロジェクトの詳細については、Susman5を参照してください。
この学生グループプロジェクトは非常に安価で、4人の学生のグループのためにセットアップするのが簡単です。必要な材料には、解剖顕微鏡、取り付けられたデジタルカメラを持つことができる蛍光化合物顕微鏡へのアクセス、ペトリプレートおよび線虫増殖寒天へのアクセス、増殖が制限された細菌(CGC由来のOP50株)、ガス炎ブンゼンバーナーまたはアルコールランプ、オートクレーブ、白金線、およびマイクロピペッター、顕微鏡スライドなどの一般的な実験室用品が含まれます。 カバースリップ、ガラスパスツールピペット。学生グループによって検査されている化学毒物に応じて、プロトコルのステップはヒュームフードの下または手袋で行われる必要があるかもしれません。このプロトコルは、水溶性(揮発性ではない)の化学混合物を使用し、製造業者が推奨するすべての安全な取り扱い手順に従います。
Protocol
Representative Results
Discussion
この原稿に記載されているプロトコルは、単独で、または数週間の独立した学生グループプロジェクトの一環として成功裏に機能します。プロトコルは、スタンドアロンの1週間の探索的経験にも適しています。線虫株は安価で、実験室で維持するのが簡単です。生徒は、ワームピックでワームを選ぶ方法や、プレートを水で洗い流し、重力で落ち着かせることによってそれらを動かす方法を…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この原稿に記載されている作業は、神経科学の中級レベルのクラスのために行われました。試薬と物資のための資金は、ヴァッサー大学の生物学部によって提供された。顕微鏡とデジタルイメージングシステムもヴァッサー大学の生物学部によって提供されました。著者は、このコースを受講した多くの学生全員に感謝します。
Materials
| Agar | Fisher Scientific | BP97445 | |
| Agarose | Fisher Scientific | MP1AGAH0250 | |
| Alcohol lamp | Fisher Scientific | 17012826 | |
| Bunsen burner | Fisher Scientific | 17-012-820 | |
| C. elegans strains | C. elegans Genetics Center | ||
| CaCl | Fisher Scientific | 10035-04-8 | |
| Cholesterol | Fisher Scientific | AAA1147030 | |
| Coverslips | Fisher Scientific | 12-545-AP | |
| Digital camera | Nikon | These can vary depending on the requirement | |
| Dissecting scope | Nikon | SMZ745 | |
| E. coli strain (OP50) | C. elegans Genetics Center | ||
| Ethanol | Fisher Scientific | BP2818100 | |
| Fluorescent scope | Nikon | These can vary depending on the requirement | |
| Imaging software | Nikon | These can vary depending on the requirement | |
| Inoculation loop | Fisher Scientific | 131045 | |
| LB Broth Base | Fisher Scientific | BP9723-500 | |
| MgSO4 | Fisher Scientific | 10034-99-8 | |
| Microfuge tubes | Fisher Scientific | 05408129 | |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 22-265446 | |
| Pasteur pipets | Fisher Scientific | 13-678-20A | |
| Petri dishes | Fisher Scientific | AS4050 | |
| Pipette tips | Fisher Scientific | 94060316 | |
| Pipetters | Fisher Scientific | 14-386-319 | |
| Platinum wire | Genesee Scientific | 59-1M30P | |
| Potassium Phosphate buffer | Fisher Scientific | AAJ61413AP | |
| Sodium azide | Fisher Scientific | AC447810250 |
References
- Duzguner, V., Erdogan, S. Chronic exposure to imidacloprid induces inflammation and oxidative stress in the liver & central nervous system of rats. Pesticide Biochemistry and Physiology. 104 (1), 58-64 (2012).
- Catae, A. F., et al. Exposure to a sublethal concentration of imidacloprid and the side effects on target and nontarget organs of Apis mellifera (Hymenoptera, Apidae). Ecotoxicology. 27 (2), 109-121 (2018).
- Bradford, B. R., Whidden, E., Gervasio, E. D., Checchi, P. M., Raley-Susman, K. M. Neonicotinoid-containing insecticide disruption of growth, locomotion, and fertility in Caenorhabditis elegans. PLOS One. 15 (9), 0238637 (2020).
- Jospin, M., et al. A neuronal acetylcholine receptor regulates the balance of muscle excitation and inhibition in Caenorhabditis elegans. PLoS Biology. 7 (12), 1000265 (2009).
- Susman, K. . Discovery-Based Learning in the Life Sciences. , (2015).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , (2006).
- Brody, H. A., Chou, E., Gray, J. M., Pokyrwka, N. J., Raley-Susman, K. M. Mancozeb-induced behavioral deficits precede structural neural degeneration. NeuroToxicology. 34, 74-81 (2013).
- Chen, P., Martinez-Finley, E. J., Bornhorst, J., Chakraborty, S., Aschner, M. Metal-induced neurodegeneration in C. elegans. Frontiers in Aging Neuroscience. 5, (2013).
- Hart, A. Behavior. WormBook. , (2006).
- Harlow, P. H., et al. The nematode Caenorhabditis elegans as a tool to predict chemical activity on mammalian development and identify mechanisms influencing toxicological outcome. Scientific Reports. 6 (1), 22965 (2016).
