Изучение влияния пестицидов на нейроны Caenorhabditis elegans
Summary
Молодые взрослые нематоды Caenorhabditis elegans подвергаются воздействию различных концентраций коммерческих пестицидов или других токсикантов в течение 2-24 ч. Затем различные нейроны могут быть визуализированы с использованием флуоресцентно-экспрессирующих штаммов. В этой статье показано, как подвергать нематод воздействию пестицидов и оценивать повреждение нейронов.
Abstract
Caenorhabditis elegans является мощным модельным организмом, используемым во многих исследовательских лабораториях для понимания последствий воздействия химических загрязнителей, пестицидов и широкого спектра токсичных веществ. С этими нематодами легко работать, и их можно использовать для получения новых результатов исследований, даже в лаборатории биологии бакалавриата. Многонедельная лабораторная серия аутентичных, управляемых студентами исследовательских проектов обучает студентов инструментарию методов и подходов в поведенческих измерениях, клеточной биологии и микроскопии, которые они затем применяют в своих проектах. Одним из методов в этом инструментарии является количественная оценка процента нейронов, проявляющих нейродегенеративное повреждение после воздействия химического токсиканта, такого как пестицид. Молодые взрослые нематоды C. elegans могут подвергаться воздействию различных концентраций коммерчески доступных пестицидов или других типов токсикантов в течение 2-24 ч. Затем студенты бакалавриата могут визуализировать различные подтипы нейронов, используя флуоресцентно-экспрессирующие штаммы C. elegans. Эти методы не требуют сложного программного обеспечения для обработки изображений и эффективны даже при низком увеличении, что делает необходимость в дорогостоящей конфокальной микроскопии ненужной. В этой статье показано, как лечить нематод пестицидами и как изображать и оценивать нейроны. Он также предоставляет простой протокол для микроскопии и анализа морфологии нейронов. Материалы, используемые для этой техники, недороги и легко доступны на большинстве факультетов биологии бакалавриата. Этот метод может быть объединен с поведенческими показателями, такими как локомоция, базальное замедление или яйцекладка, чтобы провести потенциально публикуемую серию экспериментов и дать студентам бакалавриата подлинный исследовательский опыт по очень низкой цене.
Introduction
Caenorhabditis elegans является отличным модельным организмом для лабораторного курса обучения на курсах биологических наук для студентов вводного и среднего уровня. Эта лабораторная процедура может быть использована как часть многонедельного модуля, который исследует различные эффекты обычно используемых пестицидов на поведение C. elegans и клеточную биологию. Студенты могут научиться разрабатывать и выполнять независимые проекты, которые учат их навыкам анализа данных и презентации. В этой статье основное внимание уделяется протоколам воздействия C. elegans на пестицидные смеси, а затем наблюдению и анализу влияния на морфологию нейронов.
Газонные химические пестицидные смеси широко используются для бытового и сельскохозяйственного использования и могут быть приобретены в любом местном садовом магазине. Растет обеспокоенность по поводу безопасности этих химических веществ для человека и дикой природы 1,2,3. Студенты могут читать научную литературу и выбирать пестицид для экспериментальной оценки и, таким образом, могут узнать о базовой биологии и нейробиологии, а также о важных лабораторных навыках, таких как экспериментальное проектирование и анализ, и общих лабораторных навыках, таких как пипетка и серийные разведения, рассекающая микроскопия, флуоресцентная микроскопия, цифровая фотография и производство фигур.
Протоколы, описанные в этой статье, могут стоять отдельно в курсе среднего уровня по биологии или неврологии или быть частью многонедельного модуля, который также может включать измерения поведения, управляемого определенными группами нейронов. Например, в этом протоколе описана оценка морфологии холинергических нейронов, управляющих локомоцией, с помощью штамма нематоды, экспрессирующего GFP (LX 929) в холинергических нейронах4. Эти штаммы можно получить по очень низким ценам в Центре генетики Caenorhabditis elegans (https://cgc.umn.edu/). Штаммы, экспрессирующие GFP в дофаминергических нейронах (OH 7457), холинергических нейронах (LX 929) или mCherry, экспрессируемые во всех нейронах (PVX4), являются хорошим выбором. Студенты также могут измерять локомоцию и получать данные для сопровождения оценки морфологии. Полное описание многонедельного проекта студенческой группы можно найти в Susman5.
Этот студенческий групповой проект довольно недорогой и простой в настройке для групп из четырех студентов. Необходимые материалы включают рассекающий микроскоп, доступ к флуоресцентному составному микроскопу, который может иметь прикрепленную цифровую камеру, пластины Петри и доступ к агару роста нематод, бактериям с ограничением роста (штамм OP50, из CGC), горелке Бунзена газового пламени или спиртовой лампе, автоклаву, платиновой проволоке и общим лабораторным материалам, таким как микропипеттеры, слайды микроскопа, чехлы и стеклянные пипетки Пастера. В зависимости от химического токсиканта, исследуемого студенческими группами, шаги в протоколе могут быть выполнены под вытяжным капюшоном или в перчатках. В этом протоколе используются химические смеси, которые являются водорастворимыми (не летучими), и соблюдаются все процедуры безопасного обращения, рекомендованные производителем.
Protocol
Representative Results
Discussion
Протоколы, описанные в этой рукописи, успешно работают в одиночку или в рамках многонедельного независимого проекта студенческой группы. Протоколы также поддаются автономному, недельному исследовательскому опыту. Штаммы нематод дешевы и просты в обслуживании в исследовательской лаб…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Работа, описанная в этой рукописи, была выполнена для класса среднего уровня в области неврологии. Средства на реагенты и расходные материалы были предоставлены биологическим факультетом колледжа Вассар. Микроскопы и цифровая система визуализации также были предоставлены биологическим факультетом в колледже Вассар. Автор благодарит всех многих студентов, которые прошли этот курс.
Materials
| Agar | Fisher Scientific | BP97445 | |
| Agarose | Fisher Scientific | MP1AGAH0250 | |
| Alcohol lamp | Fisher Scientific | 17012826 | |
| Bunsen burner | Fisher Scientific | 17-012-820 | |
| C. elegans strains | C. elegans Genetics Center | ||
| CaCl | Fisher Scientific | 10035-04-8 | |
| Cholesterol | Fisher Scientific | AAA1147030 | |
| Coverslips | Fisher Scientific | 12-545-AP | |
| Digital camera | Nikon | These can vary depending on the requirement | |
| Dissecting scope | Nikon | SMZ745 | |
| E. coli strain (OP50) | C. elegans Genetics Center | ||
| Ethanol | Fisher Scientific | BP2818100 | |
| Fluorescent scope | Nikon | These can vary depending on the requirement | |
| Imaging software | Nikon | These can vary depending on the requirement | |
| Inoculation loop | Fisher Scientific | 131045 | |
| LB Broth Base | Fisher Scientific | BP9723-500 | |
| MgSO4 | Fisher Scientific | 10034-99-8 | |
| Microfuge tubes | Fisher Scientific | 05408129 | |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 22-265446 | |
| Pasteur pipets | Fisher Scientific | 13-678-20A | |
| Petri dishes | Fisher Scientific | AS4050 | |
| Pipette tips | Fisher Scientific | 94060316 | |
| Pipetters | Fisher Scientific | 14-386-319 | |
| Platinum wire | Genesee Scientific | 59-1M30P | |
| Potassium Phosphate buffer | Fisher Scientific | AAJ61413AP | |
| Sodium azide | Fisher Scientific | AC447810250 |
References
- Duzguner, V., Erdogan, S. Chronic exposure to imidacloprid induces inflammation and oxidative stress in the liver & central nervous system of rats. Pesticide Biochemistry and Physiology. 104 (1), 58-64 (2012).
- Catae, A. F., et al. Exposure to a sublethal concentration of imidacloprid and the side effects on target and nontarget organs of Apis mellifera (Hymenoptera, Apidae). Ecotoxicology. 27 (2), 109-121 (2018).
- Bradford, B. R., Whidden, E., Gervasio, E. D., Checchi, P. M., Raley-Susman, K. M. Neonicotinoid-containing insecticide disruption of growth, locomotion, and fertility in Caenorhabditis elegans. PLOS One. 15 (9), 0238637 (2020).
- Jospin, M., et al. A neuronal acetylcholine receptor regulates the balance of muscle excitation and inhibition in Caenorhabditis elegans. PLoS Biology. 7 (12), 1000265 (2009).
- Susman, K. . Discovery-Based Learning in the Life Sciences. , (2015).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , (2006).
- Brody, H. A., Chou, E., Gray, J. M., Pokyrwka, N. J., Raley-Susman, K. M. Mancozeb-induced behavioral deficits precede structural neural degeneration. NeuroToxicology. 34, 74-81 (2013).
- Chen, P., Martinez-Finley, E. J., Bornhorst, J., Chakraborty, S., Aschner, M. Metal-induced neurodegeneration in C. elegans. Frontiers in Aging Neuroscience. 5, (2013).
- Hart, A. Behavior. WormBook. , (2006).
- Harlow, P. H., et al. The nematode Caenorhabditis elegans as a tool to predict chemical activity on mammalian development and identify mechanisms influencing toxicological outcome. Scientific Reports. 6 (1), 22965 (2016).
