Untersuchung der Wirkung von Pestiziden auf Caenorhabditis elegans Neuronen
Summary
Junge erwachsene Caenorhabditis elegans Nematoden sind 2-24 h lang unterschiedlichen Konzentrationen kommerzieller Pestizide oder anderer Giftstoffe ausgesetzt. Dann können verschiedene Neuronen mit fluoreszierenden exprimierenden Stämmen sichtbar gemacht werden. Dieses Papier zeigt, wie man Nematoden Pestiziden aussetzt und Neuronenschäden bewertet.
Abstract
Caenorhabditis elegans ist ein leistungsfähiger Modellorganismus, der in vielen Forschungslabors verwendet wird, um die Folgen der Exposition gegenüber chemischen Schadstoffen, Pestiziden und einer Vielzahl von toxischen Substanzen zu verstehen. Diese Nematoden sind einfach zu bearbeiten und können verwendet werden, um neue Forschungsergebnisse zu generieren, sogar im Bachelor-Biologielabor. Eine mehrwöchige Laborreihe authentischer, studentischer Forschungsprojekte schult die Studierenden in einem Toolkit von Techniken und Ansätzen in Verhaltensmessungen, Zellbiologie und Mikroskopie, die sie dann auf ihre Projekte anwenden. Eine Technik in diesem Toolkit ist die Quantifizierung des Prozentsatzes von Neuronen, die neurodegenerative Schäden aufweisen, nachdem sie einem chemischen Giftstoff wie einem Pestizid ausgesetzt waren. Junge erwachsene C. elegans-Nematoden können 2-24 h lang unterschiedlichen Konzentrationen kommerziell erhältlicher Pestizide oder anderer Arten von Giftstoffen ausgesetzt sein . Dann können Studenten verschiedene Neuronensubtypen mit fluoreszierenden exprimierenden Stämmen von C. elegans visualisieren. Diese Techniken erfordern keine ausgeklügelte Bildverarbeitungssoftware und sind selbst bei geringen Vergrößerungen wirksam, so dass die Notwendigkeit einer teuren konfokalen Mikroskopie überflüssig wird. Dieses Papier zeigt, wie man die Nematoden mit Pestiziden behandelt und wie man die Neuronen abbildet und bewertet. Es bietet auch ein einfaches Protokoll für die Mikroskopie und Analyse der Neuronenmorphologie. Die für diese Technik verwendeten Materialien sind kostengünstig und in den meisten Biologieabteilungen des Grundstudiums leicht verfügbar. Diese Technik kann mit Verhaltensmaßnahmen wie Fortbewegung, basaler Verlangsamung oder Eiablage kombiniert werden, um eine potenziell veröffentlichungsfähige Reihe von Experimenten durchzuführen und Studenten eine authentische Forschungserfahrung zu sehr niedrigen Kosten zu bieten.
Introduction
Caenorhabditis elegans ist ein ausgezeichneter Modellorganismus für die Laborausbildung in biologisch-naturwissenschaftlichen Kursen für Einsteiger und Mittelstufen. Dieses Laborverfahren kann als Teil eines mehrwöchigen Moduls verwendet werden, das verschiedene Auswirkungen häufig verwendeter Pestizide auf das Verhalten von C. elegans und die Zellbiologie untersucht. Die Studierenden können lernen, unabhängige Projekte zu entwerfen und durchzuführen, die ihnen Datenanalyse- und Präsentationsfähigkeiten vermitteln. Dieses Papier konzentriert sich auf die Protokolle zur Exposition von C. elegans gegenüber Pestizidmischungen und dann zur Beobachtung und Analyse der Auswirkungen auf die Neuronenmorphologie.
Rasenchemische Pestizidmischungen werden häufig für den privaten und landwirtschaftlichen Gebrauch verwendet und können in jedem örtlichen Gartengeschäft erworben werden. Es gibt zunehmende Besorgnis über die Sicherheit dieser Chemikalien für Mensch und Tier 1,2,3. Die Studierenden können die wissenschaftliche Literatur lesen und ein Pestizid für die experimentelle Bewertung auswählen und dabei grundlegende Biologie und Neurobiologie sowie wichtige Laborfähigkeiten wie experimentelles Design und Analyse und allgemeine Laborfähigkeiten wie Pipettieren und serielle Verdünnungen, Seziermikroskopie, Fluoreszenzmikroskopie, digitale Fotografie und Figurenproduktion erlernen.
Die in diesem Artikel beschriebenen Protokolle können in einem Mittelstufenkurs in Biologie oder Neurowissenschaften allein stehen oder Teil eines mehrwöchigen Moduls sein, das auch Messungen von Verhaltensweisen umfassen kann, die von bestimmten Gruppen von Neuronen gesteuert werden. In diesem Protokoll wird beispielsweise eine Beurteilung der Morphologie cholinerger Neuronen beschrieben, die die Fortbewegung unter Verwendung eines Nematodenstamms steuern, der GFP (LX 929) in cholinergen Neuronen4 exprimiert. Diese Stämme können zu sehr niedrigen Preisen vom Caenorhabditis elegans Genetics Center (https://cgc.umn.edu/) bezogen werden. Stämme, die GFP in dopaminergen Neuronen (OH 7457), cholinerge Neuronen (LX 929) oder mCherry, die in allen Neuronen exprimiert werden (PVX4), exprimieren, sind alle eine gute Wahl. Die Schüler konnten auch die Fortbewegung messen und Daten erhalten, um die Beurteilung der Morphologie zu begleiten. Eine vollständige Beschreibung eines mehrwöchigen Studentengruppenprojekts finden Sie in Susman5.
Dieses Studentengruppenprojekt ist recht kostengünstig und für Gruppen von vier Studenten einfach einzurichten. Zu den benötigten Materialien gehören ein Seziermikroskop, der Zugang zu einem Fluoreszenzverbindungsmikroskop, das eine angeschlossene Digitalkamera haben kann, Petriplatten und Zugang zu Nematodenwachstumsagar, wachstumsbegrenzte Bakterien (Stamm OP50, aus dem CGC), ein Gasflammen-Bunsenbrenner oder eine Alkohollampe, ein Autoklav, Platindraht und allgemeines Labormaterial wie Mikropipetter, Objektträger, Deckgläser und Pasteur-Pipetten aus Glas. Abhängig von dem chemischen Giftstoff, der von den Studentengruppen untersucht wird, müssen die Schritte im Protokoll möglicherweise unter einem Abzug oder mit Handschuhen erfolgen. Dieses Protokoll verwendet chemische Gemische, die wasserlöslich (nicht flüchtig) sind, und alle vom Hersteller empfohlenen sicheren Handhabungsverfahren werden befolgt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die in diesem Manuskript beschriebenen Protokolle arbeiten erfolgreich allein oder im Rahmen eines mehrwöchigen unabhängigen Studentengruppenprojekts. Die Protokolle sind auch für eigenständige, einwöchige Erkundungserfahrungen zugänglich. Die Nematodenstämme sind günstig und im Forschungslabor pflegeleicht. Die Schüler können leicht lernen, wie man Würmer mit einem Wurmpick pflückt oder wie man sie bewegt, indem man Platten mit Wasser spült und ihnen erlaubt, sich durch Schwerkraft abzusetzen. Die Experimen…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die in diesem Manuskript beschriebene Arbeit wurde für eine Mittelstufe in Neurowissenschaften durchgeführt. Die Mittel für die Reagenzien und Vorräte wurden von der Biologieabteilung des Vassar College zur Verfügung gestellt. Die Mikroskope und das digitale Bildgebungssystem wurden auch von der Biologieabteilung des Vassar College zur Verfügung gestellt. Der Autor dankt all den vielen Studenten, die diesen Kurs besucht haben.
Materials
| Agar | Fisher Scientific | BP97445 | |
| Agarose | Fisher Scientific | MP1AGAH0250 | |
| Alcohol lamp | Fisher Scientific | 17012826 | |
| Bunsen burner | Fisher Scientific | 17-012-820 | |
| C. elegans strains | C. elegans Genetics Center | ||
| CaCl | Fisher Scientific | 10035-04-8 | |
| Cholesterol | Fisher Scientific | AAA1147030 | |
| Coverslips | Fisher Scientific | 12-545-AP | |
| Digital camera | Nikon | These can vary depending on the requirement | |
| Dissecting scope | Nikon | SMZ745 | |
| E. coli strain (OP50) | C. elegans Genetics Center | ||
| Ethanol | Fisher Scientific | BP2818100 | |
| Fluorescent scope | Nikon | These can vary depending on the requirement | |
| Imaging software | Nikon | These can vary depending on the requirement | |
| Inoculation loop | Fisher Scientific | 131045 | |
| LB Broth Base | Fisher Scientific | BP9723-500 | |
| MgSO4 | Fisher Scientific | 10034-99-8 | |
| Microfuge tubes | Fisher Scientific | 05408129 | |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 22-265446 | |
| Pasteur pipets | Fisher Scientific | 13-678-20A | |
| Petri dishes | Fisher Scientific | AS4050 | |
| Pipette tips | Fisher Scientific | 94060316 | |
| Pipetters | Fisher Scientific | 14-386-319 | |
| Platinum wire | Genesee Scientific | 59-1M30P | |
| Potassium Phosphate buffer | Fisher Scientific | AAJ61413AP | |
| Sodium azide | Fisher Scientific | AC447810250 |
References
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