Undersöker effekten av bekämpningsmedel på Caenorhabditis elegans Neurons
Summary
Unga vuxna Caenorhabditis elegans nematoder utsätts för olika koncentrationer av kommersiella bekämpningsmedel eller andra giftiga ämnen i 2-24 timmar. Sedan kan olika neuroner visualiseras med hjälp av fluorescerande uttryckande stammar. Detta dokument visar hur man utsätter nematoder för bekämpningsmedel och bedömer neuronskador.
Abstract
Caenorhabditis elegans är en kraftfull modellorganism som används i många forskningslaboratorier för att förstå konsekvenserna av exponering för kemiska föroreningar, bekämpningsmedel och en mängd olika giftiga ämnen. Dessa nematoder är lätta att arbeta med och kan användas för att generera nya forskningsresultat, även i grundutbildningsbiologilaboratoriet. En flerveckors laboratorieserie av autentiska, studentdrivna forskningsprojekt tränar studenterna i en verktygslåda med tekniker och tillvägagångssätt inom beteendemätningar, cellbiologi och mikroskopi som de sedan tillämpar på sina projekt. En teknik i den verktygslådan är att kvantifiera andelen neuroner som uppvisar neurodegenerativ skada efter exponering för ett kemiskt toxiskt ämne som ett bekämpningsmedel. Unga vuxna C. elegans nematoder kan utsättas för olika koncentrationer av kommersiellt tillgängliga bekämpningsmedel eller andra typer av giftiga ämnen i 2-24 timmar. Sedan kan studenter på grundnivå visualisera olika neuronundertyper med hjälp av fluorescerande uttryckande stammar av C. elegans. Dessa tekniker kräver inte sofistikerad bildbehandlingsprogramvara och är effektiva vid även låga förstoringar, vilket gör behovet av dyr konfokalmikroskopi onödig. Detta dokument visar hur man behandlar nematoderna med bekämpningsmedel och hur man avbildar och poängsätter neuronerna. Det ger också ett enkelt protokoll för mikroskopi och analys av neuronmorfologi. Materialen som används för denna teknik är billiga och lättillgängliga i de flesta grundutbildningsbiologiska avdelningar. Denna teknik kan kombineras med beteendemässiga åtgärder som rörelse, basal bromsning eller äggläggning för att genomföra en potentiellt publiceringsbar serie experiment och ge studenter en autentisk forskningsupplevelse till en mycket låg kostnad.
Introduction
Caenorhabditis elegans är en utmärkt modellorganism för laboratoriekursutbildning i biologiska vetenskapskurser för introduktions- och mellannivåstudenter. Denna laboratorieprocedur kan användas som en del av en flerveckorsmodul som utforskar olika effekter av vanliga bekämpningsmedel på C. elegans beteende och cellbiologi. Studenterna kan lära sig att designa och genomföra självständiga projekt som lär dem dataanalys och presentationsförmåga. Denna uppsats fokuserar på protokollen för att utsätta C. elegans för bekämpningsmedelsblandningar och sedan observera och analysera effekterna på neuronmorfologi.
Gräsmattor kemiska bekämpningsmedelsblandningar används ofta för bostads- och jordbruksbruk och kan köpas i alla lokala trädgårdsbutiker. Det finns en ökande oro för säkerheten för dessa kemikalier för människor och vilda djur 1,2,3. Studenter kan läsa den vetenskapliga litteraturen och välja ett bekämpningsmedel för experimentell utvärdering och därigenom lära sig om grundläggande biologi och neurobiologi, liksom viktiga laboratoriefärdigheter som experimentell design och analys, och allmänna laboratoriefärdigheter som pipettering och seriella utspädningar, dissekeringsmikroskopi, fluorescerande mikroskopi, digital fotografering och figurproduktion.
Protokollen som beskrivs i detta papper kan stå ensamma i en kurs på mellannivå i biologi eller neurovetenskap eller vara en del av en flerveckorsmodul som också kan innehålla mätningar av beteenden som styrs av särskilda grupper av neuroner. Till exempel beskrivs i detta protokoll en bedömning av morfologin hos kolinerga neuroner som styr rörelse med användning av en stam av nematod som uttrycker GFP (LX 929) i kolinerga neuroner4. Dessa stammar kan erhållas till mycket låga priser från Caenorhabditis elegans Genetics Center (https://cgc.umn.edu/). Stammar som uttrycker GFP i dopaminerga neuroner (OH 7457), kolinerga neuroner (LX 929) eller mCherry uttryckt i alla neuroner (PVX4) är alla bra val. Eleverna kunde också mäta rörelse och få data som åtföljer bedömningen av morfologi. En fullständig beskrivning av ett flerveckors studentgruppsprojekt finns i Susman5.
Detta studentgruppsprojekt är ganska billigt och enkelt att ställa in för grupper om fyra studenter. Materialen som behövs inkluderar ett dissekeringsmikroskop, tillgång till ett fluorescensföreningsmikroskop som kan ha en ansluten digitalkamera, petriplattor och tillgång till nematodtillväxtagar, tillväxtbegränsade bakterier (stam OP50, från CGC), en gasflamma Bunsen-brännare eller en alkohollampa, en autoklav, platinatråd och allmänna laboratorietillbehör som mikropipetters, mikroskopglas, täckglas och glas Pasteur pipetter. Beroende på vilket kemiskt toxiskt ämne som undersöks av studentgrupperna kan stegen i protokollet behöva ske under en dragskåp eller med handskar. Detta protokoll använder kemiska blandningar som är vattenlösliga (inte flyktiga), och alla säkra hanteringsförfaranden som rekommenderas av tillverkaren följs.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollen som beskrivs i detta manuskript fungerar framgångsrikt ensamma eller som en del av ett flera veckors självständigt studentgruppsprojekt. Protokollen är också mottagliga för fristående, en veckas utforskande upplevelser. Nematodstammarna är billiga och lätta att underhålla i forskningslaboratoriet. Eleverna kan lätt lära sig att plocka maskar med en maskplockning eller hur man flyttar dem genom att spola plattor med vatten och låta dem bosätta sig genom tyngdkraften. Experimenten kan utföras und…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Arbetet som beskrivs i detta manuskript gjordes för en mellannivåklass i neurovetenskap. Medel för reagenser och förnödenheter tillhandahölls av biologiska avdelningen vid Vassar College. Mikroskopen och det digitala bildsystemet tillhandahölls också av biologiska avdelningen vid Vassar College. Författaren tackar alla de många studenter som tog denna kurs.
Materials
| Agar | Fisher Scientific | BP97445 | |
| Agarose | Fisher Scientific | MP1AGAH0250 | |
| Alcohol lamp | Fisher Scientific | 17012826 | |
| Bunsen burner | Fisher Scientific | 17-012-820 | |
| C. elegans strains | C. elegans Genetics Center | ||
| CaCl | Fisher Scientific | 10035-04-8 | |
| Cholesterol | Fisher Scientific | AAA1147030 | |
| Coverslips | Fisher Scientific | 12-545-AP | |
| Digital camera | Nikon | These can vary depending on the requirement | |
| Dissecting scope | Nikon | SMZ745 | |
| E. coli strain (OP50) | C. elegans Genetics Center | ||
| Ethanol | Fisher Scientific | BP2818100 | |
| Fluorescent scope | Nikon | These can vary depending on the requirement | |
| Imaging software | Nikon | These can vary depending on the requirement | |
| Inoculation loop | Fisher Scientific | 131045 | |
| LB Broth Base | Fisher Scientific | BP9723-500 | |
| MgSO4 | Fisher Scientific | 10034-99-8 | |
| Microfuge tubes | Fisher Scientific | 05408129 | |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 22-265446 | |
| Pasteur pipets | Fisher Scientific | 13-678-20A | |
| Petri dishes | Fisher Scientific | AS4050 | |
| Pipette tips | Fisher Scientific | 94060316 | |
| Pipetters | Fisher Scientific | 14-386-319 | |
| Platinum wire | Genesee Scientific | 59-1M30P | |
| Potassium Phosphate buffer | Fisher Scientific | AAJ61413AP | |
| Sodium azide | Fisher Scientific | AC447810250 |
References
- Duzguner, V., Erdogan, S. Chronic exposure to imidacloprid induces inflammation and oxidative stress in the liver & central nervous system of rats. Pesticide Biochemistry and Physiology. 104 (1), 58-64 (2012).
- Catae, A. F., et al. Exposure to a sublethal concentration of imidacloprid and the side effects on target and nontarget organs of Apis mellifera (Hymenoptera, Apidae). Ecotoxicology. 27 (2), 109-121 (2018).
- Bradford, B. R., Whidden, E., Gervasio, E. D., Checchi, P. M., Raley-Susman, K. M. Neonicotinoid-containing insecticide disruption of growth, locomotion, and fertility in Caenorhabditis elegans. PLOS One. 15 (9), 0238637 (2020).
- Jospin, M., et al. A neuronal acetylcholine receptor regulates the balance of muscle excitation and inhibition in Caenorhabditis elegans. PLoS Biology. 7 (12), 1000265 (2009).
- Susman, K. . Discovery-Based Learning in the Life Sciences. , (2015).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , (2006).
- Brody, H. A., Chou, E., Gray, J. M., Pokyrwka, N. J., Raley-Susman, K. M. Mancozeb-induced behavioral deficits precede structural neural degeneration. NeuroToxicology. 34, 74-81 (2013).
- Chen, P., Martinez-Finley, E. J., Bornhorst, J., Chakraborty, S., Aschner, M. Metal-induced neurodegeneration in C. elegans. Frontiers in Aging Neuroscience. 5, (2013).
- Hart, A. Behavior. WormBook. , (2006).
- Harlow, P. H., et al. The nematode Caenorhabditis elegans as a tool to predict chemical activity on mammalian development and identify mechanisms influencing toxicological outcome. Scientific Reports. 6 (1), 22965 (2016).
