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Neuroscience

解剖学的に特異的な単一細胞遺伝子発現法による依存行動における反報酬の要因の調査

Published: August 4, 2022 doi: 10.3791/64014
Automatic Translation
*1,2,3, *1, 1, 1
1Daniel Baugh Institute for Functional Genomics and Computational Biology, Department of Pathology, Anatomy, and Cell Biology, Thomas Jefferson University, 2Sidney Kimmel Medical College, Thomas Jefferson University, 3Department of Psychiatry and Behavioral Sciences, Stanford University School of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

レーザーキャプチャーマイクロダイセクションとマイクロ流体RT-qPCRの組み合わせは、単一ニューロンおよびグリアのトランスクリプトームを測定する際に解剖学的およびバイオテクノロジーの特異性を提供します。精神疾患に対するシステムの生物学的アプローチによる創造的な方法を適用することは、依存症における神経炎症反報酬仮説などの理解と治療におけるブレークスルーにつながる可能性があります。

Abstract

依存症行動の割合の増加により、メンタルヘルスの研究者と臨床医は同様に、反報酬と回復を理解するようになりました。報酬と開始からのこのシフトは、依存症を調査するために適用される方法の拡張とともに、新しい視点、パラダイム、および仮説を必要とします。ここでは、レーザーキャプチャーマイクロダイセクション(LCM)とハイスループットマイクロ流体逆転写定量ポリメラーゼ連鎖反応(RT-qPCR)を組み合わせたアンチリターンを調査するためのシステム生物学的アプローチの例を紹介します。遺伝子発現ネットワークのダイナミクスが測定され、アルコールおよびオピオイド離脱における神経内臓調節不全の主要な推進力である神経炎症が特定されました。この技術の組み合わせは、ハイスループット感度と特異的遺伝子発現測定により、単一細胞分解能で解剖学的および表現型の特異性を提供し、仮説生成データセットと新しい洞察と治療の機会を生み出す機構的可能性の両方を生み出します。

Introduction

依存症は依然として先進国で増大する課題です1,2。科学的および臨床的大きな進歩にもかかわらず、依存症の割合は増加し続けていますが、確立された治療法の有効性はせいぜい安定しています3,4,5。しかし、バイオテクノロジーと科学的アプローチの進歩は、物質依存の病態生理学をさらに調査するための新しい方法と仮説をもたらしました6,7,8。実際、最近の進展は、新しい概念と治療パラダイムが社会的、経済的、政治的結果を伴うブレークスルーにつながる可能性があることを示唆しています9,10,11,12。

アルコールの離脱とオピオイド依存症における反報酬を調査した13,14,15,16。メソッドはこのパラダイムの中心です17,18。レーザーキャプチャーマイクロダイセクション(LCM)は、解剖学的特異性の高い単一細胞を選択できます。この機能は、グリアとニューロンの両方を同じ動物の同じニューロン亜核から収集および分析できるため、神経炎症反報酬仮説に不可欠です13、14、15、16、19。次に、選択された細胞のトランスクリプトームの関連部分を、ハイスループットマイクロ流体逆転写定量的ポリメラーゼ連鎖反応(RT-qPCR)で測定することができ、機能ネットワークへの洞察をもたらす計算分析のための高次元データセットを提供する20,21。

特定の脳核のニューロンとグリアのトランスクリプトームのサブセットを測定すると、サンプル数と測定された遺伝子の両方で堅牢で、感度と特異的なデータセットが生成されます。これらのツールは、グリア、主に星状細胞とミクログリアが過去10年間に神経疾患および精神疾患の中心的な役割を示してきたため、精神疾患に対するシステムの神経科学的アプローチに最適です22,23。私たちのアプローチは、局所的なパラクリンシグナル伝達に関与する多数の受容体とリガンドにわたって同時にグリアとニューロンの発現応答を測定することができます。実際、シグナリングは、ファジィ論理24などの様々な定量的方法を用いて、これらのデータセットから推論することができる。さらに、ニューロンまたはグリアにおける細胞サブ表現型とその機能の同定は、特定の核の脳細胞が単一細胞レベルでどのように組織化、応答、および調節不全になるかについての洞察を提供することができます。この機能システムのダイナミクスは、時系列実験16でモデル化することもできます。最後に、動物モデルを解剖学的または薬理学的に摂動して、このシステムのアプローチに機構的状態を与えることができます。

代表的な実験:
以下に、これらの方法の適用例を示します。この研究では、アルコール依存とその後の離脱に応答した孤立核(NTS)におけるラットのニューロンおよびミクログリア遺伝子発現を調査しました16。ラットコホートは、1)対照、2)エタノール依存性(EtOH)、3)8時間離脱(Wd)、4)32時間Wd、および5)176時間Wdから構成されていました(図1A)。急速な断頭に続いて、脳幹を前脳から分離して凍結切片化し、チロシンヒドロキシラーゼ陽性(TH+)ニューロンおよびミクログリアについてスライスを染色した(図1B)。LCMは、TH+およびTH-ニューロンおよびミクログリアの両方を収集するために使用されました。すべての細胞はNTSからのものであり、10細胞プールのサンプルとして分析されました。4つの96 x 96マイクロ流体RT-qPCRダイナミックアレイを、65個の遺伝子を測定するRT-qPCRプラットフォームで実行しました(図1B-C)。データは-ΔΔCT法を用いて正規化し、Rを用いて解析し、単一細胞選択を分子マーカーで検証した(図1D-E)。技術的検証は、単一のバッチ内およびバッチ間で分析された技術反復によってさらに検証されました(図2および図3)。TH+ニューロンとTH-ニューロンは、炎症性遺伝子クラスターは類似しているがγ-アミノ酪酸(GABA)受容体(R)クラスターが異なる異なるサブ表現型に編成されています(図4および図5)。炎症性遺伝子クラスターの発現が上昇したサブ表現型は32時間Wdで過剰発現したが、GABA受容体(GABAR)発現は長期のアルコール離脱(176時間Wd)で低いままであった。この研究は、離脱中の内臓からの傍受的フィードバックが内臓感情神経核(すなわち、NTSおよび扁桃体)の調節不全に寄与し、より重度の自律神経および感情的後遺症をもたらし、物質依存に寄与すると推測するアルコールおよびオピオイド依存の反報酬仮説に貢献しています(図6)。

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Protocol

この研究は、トーマスジェファーソン大学の動物管理および使用委員会(IACUC)の勧告に従って実施されました。プロトコルはトーマスジェファーソン大学IACUCによって承認されました。

1. 動物モデル

  1. ハウスオスのSprague Dawley(>120 g、ハーラン、インディアナポリス、インディアナ州、米国)ラットトリプレットを個別にエタノールチャウ(2匹のラット)またはコントロールチャウ混合物(1匹のラット)に無料でアクセスします。
    注:この代表的な実験では、Lieber-DeCarliプロトコルを使用して、アルコール離脱の神経生物学を研究しました25,26。ラットトリプレットは、同じカロリー数を与えられる3匹のラットコホートで構成されていますが、犠牲にして研究の異なるアームに終わります。この研究の3つのアームは、1)対照、2)エタノール依存性(EtOH)、および3)離脱(Wd)です(図1A)。この研究では、3つのアルコール離脱時点があるため、合計5つの条件があります(図1A)。
    1. 一日おきに、Wdラットによって消費されたエタノール-固形混合物を測定し、消費された量を同量のエタノール混合物とEtOHラットフィーダーに交換する。同等のカロリー量のコントロール混合物をコントロールラットのフィーダーに追加します。.
      注:1日の平均エタノール消費量は、3週間後に約12〜16 g / kgです26。
    2. 安定した長期エタノール消費と依存(>5週間)の後、Wdラットの食品容器を空にして対照混合物で満たすことにより、Wdラットに急性アルコール離脱を誘発します。.3匹のラットすべてが同じ概日時点21で犠牲になるようにこれを実行する。
    3. 事前に選択した時点で、トリプレットの3匹のラットすべてを同じ時点で犠牲にします(Control、EtOH、およびWd)。

2.サンプル採取

  1. 適切なWd時点(8時間、32時間、176時間)で各ラットトリプレットの同じ概日時点で脳を収穫します。
    1. RNAの完全性を維持するために、新鮮な組織を急速に冷却するためのメタノールとドライアイスバスを準備します。横に置きます。
    2. ラットをイソフルランタンク(酸素中5%)に~30秒間、または呼吸数の低下と運動活動の欠如によって示されるように意識喪失が起こるまで入れます。.ラットの頭を適切に鋭利にしたギロチンに入れて、すばやく斬首します。
    3. 動物の頭蓋骨を開き、鉗子を使用して脳を解剖します。手持ちカミソリで新鮮な脳から小脳をグロススライスして取り除き、廃棄します。横切開により、前脳から脳幹をスライスします。
      注:ハンドヘルドカミソリをさらに使用して、実験デザインに従って前脳または脳幹を左右の半球に半分割することができます。たとえば、1 つの半球からの結果を異なる方法で検証するには、左右の発散を調査するか、サンプル数を増やします。
    4. 組織サンプルを完全に浸すことができるように、組織埋め込み金型に最適な切断温度(O.C.T.)媒体を約3〜4 cmの深さに追加します。組織、前脳および/または脳幹を組織埋め込み型に入れ、組織サンプルを完全に覆うためにO.C.T.を追加します。
    5. 組織サンプル(ラット前脳)を含むプラスチック組織包埋型をドライアイスとメタノールの冷却浴に追加し、組織サンプルを直ちに凍結させます。埋め込み型内の組織サンプルを、組織の収集が完了するまで冷却槽に残しますが、15分以内です。
      注意: メタノールがティッシュ容器にこぼれないように注意してください。
    6. 組織サンプルを-80°Cで迅速に保存します。
      注:マイクロ流体RT-qPCRは、mRNA転写物を増幅および測定することにより、遺伝子発現を測定します。これらの転写物は比較的不安定であるため、このプロセスでは、mRNAの分解を防ぐためにサンプルをできるだけ冷たく保つために多くの手順が取られます。

3.凍結切片

注:ラットの神経核は約10μmです。したがって、10 μmがこの動物モデルに最適なスライス厚さです。スライスの厚さは、研究のための動物モデルに従って調整される。

  1. -80°Cの冷凍庫から、凍結脳幹を含む組織包埋型を取り出し、サンプルをクライオスタットで-20°Cで5〜10分間解凍します。mRNA保存のために、この-20°Cへの凍結融解を1回だけ行う。
  2. ハンドヘルドカミソリを使用して、プラスチック埋め込み型の角を垂直に切ります。O.C.T.に埋め込まれた脳幹をプラスチック組織埋め込み型から取り出します。-20°Cに設定したクライオスタットのチャックに、室温の液体O.C.T.を接着剤として使用し、冠状動脈凍結切開のために吻側から尾側に脳幹を取り付けます。
  3. 関心領域(NTS)を含む切片に達するまで、ラットの脳幹から吻側から尾側の10μmの冠状凍結切片を切断します。これらの凍結切片の高さと幅は、プラスチック埋め込み金型の寸法に基づいて~200mmです。
  4. NTSを含む脳幹組織の10 μm凍結切片、または研究に基づく他の関心領域を、室温のプレーンスライドガラスに解凍マウントして収集します。すばやく、これらのスライドをセクションとともにドライアイスの上にある冷却金属鍋に入れます。できるだけ早く、凍結切片を含むスライドガラスを-80°Cの冷凍庫に入れて保管します。
    注:幅と高さが~200 mmであるため、1つのスライドガラスに複数の10 μm凍結切片を取り付けることができます。したがって、同じスライドに、異なる細胞型について染色された凍結切片を含めることができます。
    1. スライド上に複数のセクションがある場合は、それらが100 mmの空きスペースで区切られていることを確認してください。凍結切片の間に境界線を作成するには、疎水性ペンを使用します。これにより、同じスライドガラス上で異なる細胞タイプに対して異なる抗体溶液を染色することができます。スライドガラスの端から凍結切片用のスペースを20mm維持します。

4. 単一細胞の免疫蛍光染色

  1. 脳凍結切片で迅速な染色免疫蛍光プロトコルを使用して、LCMを使用して収集する目的の脳細胞タイプ(ニューロン、ミクログリア、アストロサイトなど)を標識します。
    注:これらの実験に使用された免疫組織化学染色プロトコルは、このプロセス中の過剰なmRNA分解を防ぐために迅速になるように設計されました。
    1. -80°Cの冷凍庫から、NTSを含むラット脳幹の10μm凍結切片を含むスライドガラスを取り出します。スライドを75%エタノール浴に30秒間浸して、凍結切片組織を固定します。余分な液体を取り除きます。
    2. 固定凍結切片脳幹組織に、抗体の非標的結合をブロックするために、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)中の2%ウシ血清アルブミン(BSA)を30秒間塗布します。その後、PBSで洗ってください。
    3. 凍結切片組織を覆うのに十分な量の一次抗体溶液を塗布します(現在は固定およびブロックされています)。組織切片を一次抗体溶液中で2分間インキュベートします。2%BSA溶液で組織を一度洗浄します。一次抗体溶液には、ブロッキング用のBSA-PBS溶液の96%、一次抗体3%、およびRNase阻害剤1%が含まれています。一次抗体を1:25の比率で希釈した。
      注:この代表的な実験では、一次抗体は抗NeuN抗体と抗Cd11β抗体で構成されています。ニューロンはさらにTH+とTH-サブグループに細分されたため、ニューロン染色用の一次抗体溶液には、BSA PBS溶液の93%、抗NeuN抗体3%、抗チロシンヒドロキシラーゼ抗体3%、およびRNase Out1%が含まれていました。
    4. 脳幹組織を覆うのに十分な量の二次抗体(1:200)溶液を塗布します。二次抗体溶液を組織に浸します。3分後、2%BSA溶液で組織を1回洗浄する。
      注:二次抗体を含む溶液は、196.5 μLの2%BSA、1 μLのヤギ抗マウス555 nm蛍光タグ、TH染色用の1 μLのロバ抗ウサギAlexa 488 nm、2.5 μLのRNase阻害剤、および1.3 μLのDAPI(1:10000)で構成されていました。

5.標準的なエタノールおよびキシレン組織脱水シリーズ

  1. 染色された凍結切片組織を75%エタノール浴に30秒間置くスライドガラスを置き、続いて95%エタノール浴に30秒間、100%エタノール浴に30秒間、最後に100%エタノールを両方とも30秒間(第2の容器に入れる)。
  2. エタノール脱水シリーズが完了したら、2つの新鮮な100%キシレン浴を注ぎます。次に、スライドガラスを最初のキシレン浴に1分間置きます。スライドをすばやく取り外して、もう一方の新鮮なキシレンバスに4分間入れます。
  3. キシレンから染色および脱水された組織凍結切片を含むスライドガラスを取り出し、暗いが換気された容器に5分間置き、風乾します。風乾後、スライドガラスをデシケーターに5分間入れて最終乾燥させます。

6. レーザーキャプチャーマイクロダイセクション(LCM)を使用した単一細胞の選択

  1. 染色、固定、脱水した組織凍結切片を含むスライドガラスをLCM顕微鏡サンプルホルダーに挿入します。解剖学的ランドマークを使用して、細胞収集が行われる関心領域を特定します(この代表的な例ではNTS)。
  2. 顕微鏡蛍光をオンにして、目的の染色された細胞タイプを見つけます。目的の細胞の核が関心領域にあり、他の細胞の核から>3 mmの距離で分離されていることを確認します。LCMソフトウェアを使用して収集する1つの細胞(実験が真の単一細胞の場合)または複数の細胞(この代表的な実験で実証されているように、実験でプールされた単一細胞サンプル[つまり、単一細胞スケール]が必要な場合)を特定してマークします。
    注:この代表的な実験では、10セルプールで構成されるサンプルを使用しました。これは、サンプル間の遺伝子発現の変動を減らし、分析される単一細胞の数を増やすために行われますが、これはまだ単一細胞スケールの実験のままです。真の単一細胞実験は、この方法20、27で完了することができる。さらに、より大きな組織切片も選択することができる21。
  3. 目的の細胞を選択したら、LCMロボットアームを使用して、マークされた組織凍結切片の関心領域にLCMキャップを置きます。
  4. テストショットを使用して、赤外線(IR)レーザーの強度とターゲティングを調整します。
    注:これはサンプルごとに行われます。キャリブレーションは、非実験組織を誤って選択しないように、組織の真上ではないキャップのセクションで実行する必要があります。
    1. 強度を較正するには、IRレーザーショットの持続時間、強度、およびサイズを調整して、ショットが単一の細胞核を選択するのに十分なキャップ接着剤のみを溶かし、スライド上の凍結切片までキャップを溶かすのに十分な強度になるようにします。これらの値はキャップごとに異なります。
    2. レーザーがキャップを溶かした場所にレーザー十字線を正確に位置させることで、ターゲティングを調整します。
  5. LCM赤外線レーザーを発射して同定した細胞を集め、それらの細胞の上の凍結切片組織にキャップを溶かします。ロボットアームを使用してキャップをLCM顕微鏡の品質管理(QC)領域に配置することにより、選択した細胞のみが組織スライスから持ち上げられたことを確認します。キャップ上の余分な細胞を取り除くには、紫外線(UV)レーザーを使用して余分な細胞の遺伝物質を消し去ります。
  6. LCMソフトウェアカメラで解剖学的特異性を記録します。細胞が除去された凍結切開組織の写真を撮ります。
  7. 解剖学的アトラス(この例ではラット前脳のアトラス)を使用して、ブレグマからのこの組織スライスの距離を決定し、この情報をZ距離28として記録します。写真からX面および/またはY平面内の位置を決定して、選択したセルを完全にローカライズします。
  8. 手袋をはめた手で、QC領域からLCMキャップを取り外します。次に、サンプル抽出装置をLCMキャップに固定します。ピペットを使用して、選択した細胞に5.5 μLの溶解バッファーを適用します。これは現在、サンプルと呼ばれています。
    注:溶解バッファー溶液は、5 μLの再懸濁バッファーと0.5 μLの溶解エンハンサーで構成されています。
  9. 0.5 mLの微量遠心チューブを、LCMキャップに取り付けられたサンプル抽出装置に取り付けます。この配置を75°Cのホットプレートに置き、サンプルと溶解バッファーをプレートに近づけます。サンプルを15分間加熱します。
  10. 0.01〜0.02 x g の低速遠心分離機を使用して、サンプルと溶解バッファーを0.5 mLマイクロ遠心チューブの底に回転させます。マイクロ流体qPCRまでサンプルを-80°Cで保存します。

7. プラットフォーム上のマイクロ流体RT-qPCR上でqPCRチップを実行します

  1. シングルセルサンプルの遺伝子発現を測定するには、以下に説明するようにmRNAプレアンプレーションを実行します。
    注:サンプルは非常に少量のRNA(10 pg)を含む単一細胞であり、mRNA単離ステップ中に失われるため、プロトコルにはmRNA抽出は含まれません。単一細胞は溶解され、サンプルの損失を最小限に抑えるために逆転写のために直接進行します。
    1. アッセイするすべての遺伝子のmRNA qPCR遺伝子プライマー(順方向および逆方向)を1.5 mLのマイクロ遠心チューブに追加して、プライマープールを作成します。各プライマーの最終濃度が500 nMであることを確認してください。本実施例実験におけるプライマーは、補足表1から16に記載される。
    2. 1 μLの5x cDNA反応ミックスを96ウェルPCRプレートの各ウェルにピペットで入れます。
    3. 単一細胞サンプルを-80°Cの冷凍庫から取り出し、室温で放置することにより、短時間(2〜3分)解凍します。0.01-0.02 x g の低速遠心分離機を使用して、サンプルを20-30秒間スピンダウンします。 各単一細胞サンプル5.5 μLを96ウェルPCRプレートの異なるウェルにピペットで移します。
      注:各ウェルに入れるサンプル番号とタイプは、このステップを開始する前に決定されます。
    4. 96ウェルPCRプレートには、cDNA反応ミックスと各ウェルへのシングルセルサンプルが追加されています。このプレートをサーモサイクラーに65°Cで1.5分間入れ、cDNA反応混合物を活性化します。1,300 x g の高速遠心分離で4°Cで1分間かけて内容物をスピンダウンし、PCRプレートをウェットアイスの上に置きます。
    5. PCRプレートの各ウェルに、0.12 μLのT4遺伝子32タンパク質、0.73 μLのDNA懸濁液バッファー、および0.15 μLの10x cDNA合成マスターミックスをピペットで入れます。サーモサイクラーでPCRプレートを次のプロトコルで実行します:25°Cで5分間、50°Cで30分間、55°Cで25分間、60°Cで5分間、70°Cで10分間、および4°Cで最終ホールドします。
      注:T4遺伝子32タンパク質(一本鎖DNA(ssDNA)結合タンパク質)は、バクテリオファージT4の複製と修復に必要です。T4遺伝子32タンパク質は、逆転写の収率と効率を改善し、PCR産物の収率を高めるために、プロトコルの逆転写ステップで使用されました。
    6. PCRプレートの各ウェルに、7.5 μLのTaqポリメラーゼマスターミックスをピペットで入れます。これに続いて、各ウェルに、ステップ7.1.1で作成したプライマープール1.5 μLをピペットで入れた。PCRプレートをサーモサイクラーで次のリニアプリアンプステップに通します:95°Cで10分間;22サイクル:96°Cで5秒、60°Cで4分間。
    7. PCRプレートの各ウェルに、1.2 μLのエキソヌクレアーゼI、4.2 μLのDNA懸濁液バッファー、および0.6 μLの10xエキソヌクレアーゼI反応バッファーをピペットで入れます。サーモサイクラーでPCRプレートを次のプロトコルで実行します:37°Cで30分間、80°Cで15分間。
      注:エキソヌクレアーゼは、直鎖状一本鎖DNAから3'から5'方向にヌクレオチドを除去する触媒となります。エキソヌクレアーゼは、取り込まれていないプライマーや、事前増幅後に存在する可能性のある一本鎖cDNAを除去するためのサンプルクリーンアップに使用します。
    8. PCRプレート内の各ウェルに、54 μLのTEバッファーをピペットで入れます。1,300 x g の高速遠心分離機を4°Cで5分間使用して、PCRプレートの内容物をスピンダウンします。
    9. プロトコルの次のフェーズを継続する場合は、PCRプレートを4°Cで冷蔵します。 プレアンプフェーズの完了からマイクロ流体qPCRの開始までに12時間以上かかる場合は、qPCRプレートを覆い、-20°Cの冷凍庫に入れます。
  2. 下記のようにqPCRチップ用のサンプルプレート(新しい96ウェルPCRプレート)を作成します。
    1. ステップ7.1のプリアンプPCRプレートを-20°Cの冷凍庫に入れた場合は、取り出し、室温で10分間解凍します。
    2. 新しい96ウェルPCRプレートに、4.55 μLのPCRスーパーミックス低ロックスと0.45 μLの20x DNA結合色素を各ウェルにピペットで入れます。次いで、ステップ7.1で作製したPCRプレートから3μLの予め増幅されたサンプルをピペットで採取する。1,300 x g で4°Cで5分間の高速遠心分離を使用してPCRプレートをスピンダウンし、PCRサンプルプレートを氷上に置きます。
  3. 下記のようにqPCRチップ用のアッセイプレート(新しい96ウェルPCRプレート)を作成します。
    1. 新しい96ウェルPCRプレートに、各ウェルに1.25 μLのDNA懸濁液バッファーと3.75 μLの2xアッセイローディング試薬をピペットで入れます。次に、対応するqPCRプライマーを2.5 μLの10 μMプライマーでピペットで行います。1,300 x gの高速遠心分離機を4°Cで5分間使用し、PCRプレートをスピンダウンし、PCRアッセイプレートを氷上に置きます。
  4. 以下に説明するように、マイクロ流体RT-qPCRプラットフォームにロードするためのqPCRチップを準備します。
    注:qPCRチップは、マイクロ流体原理で動作するリアルタイムqPCRプラットフォームです。qPCRチップは、基本的に96個のサンプルチャンネルと96個のRNA qPCRプライマーチャンネル(すなわちアッセイ)のマトリックスであり、9,216(96 x 96)チャンバー内で交差します。サンプルと特定のアッセイは、リアルタイムのqPCR反応が起こるアレイの各チャンバーで組み合わされます。読み出しは、使用するプライマーの閾値サイクル(Ct)値および増幅プロットとして生成されます。
    1. プライミングのためにコントロールライン液をqPCRチップに注入します。qPCRチップをマイクロ流体混合装置に挿入します。プライム(136x)スクリプトを選択し、このプログラムを実行します。
    2. ~45分後にプログラムが完了したら、プライミングされたqPCRチップを取り外します。プライミングしたqPCRチップに、PCRサンプルプレートからqPCRチップ内の対応するサンプルウェルに6 μLの反応液をピペットで入れます。
    3. プライミングしたqPCRチップに、PCRアッセイプレートからqPCRチップ内の対応するアッセイウェルに6 μLの反応液をピペットで入れます。
      注:qPCRチップのサンプルおよびアッセイウェルの底部に気泡が形成され、溶液がマイクロ流体導管に入るのを妨げる可能性があります。qPCRチップをマイクロ流体混合装置に挿入する前に、鋭利な針を使用してこれらの気泡をはじいたり除去したりすることができます。
    4. qPCRチップをマイクロ流体混合装置に挿入します。ロードミックス(136x)スクリプトを選択し、このプログラムを実行します。
  5. qPCRチップをマイクロ流体RT-qPCRプラットフォームにロードします。
    1. マイクロ流体RT-qPCRプラットフォームの電源を入れ、電球を温めます(~20分)。マイクロ流体混合装置からqPCRチップを取り外します。qPCRチップの下部から保護ステッカーをはがします。
    2. マイクロ流体RT-qPCRプラットフォームを開き、qPCRチップをマイクロ流体RT-qPCRプラットフォームにロードします。マイクロ流体RT-qPCRプラットフォームで高速96 x 96 PCRプロトコル(30サイクル)を実行します。
    3. データ収集ソフトウェアを起動します-[ 新しい実行の開始]をクリックします。
    4. チップバーコードを確認し、チップタイプをクリックして[ 次へ]をクリックします。 Chip Run ファイルをクリックし、データ収集ストレージのファイルの場所を参照します。
    5. アプリケーションタイプをクリックし、遺伝子発現を選択します。パッシブリファレンスにはROXを選択し、シングルプローブを選択し、プローブタイプにはEvaGreenを選択します。
    6. クリックして熱サイクルプログラムを選択し、 バイオマークHD:GEファスト96x96 PCR+メルトv2.pclファイルを選択します。

8.データ分析

  1. 以下に説明するように、qPCRチップランからQC用の分析ソフトウェアにデータをアップロードします。
    1. データ分析ソフトウェアをダウンロードします。これは、次のWebサイトにあります:https://www.fluidigm.com/products-services/software#。ソフトウェアを起動して、マイクロ流体RT-qPCR実験を分析します。
    2. ソフトウェア内で、 チップランを開きます。次に、実験によって作成された ChipRun.bml ファイルを開きます。パッシブリファレンス、プローブ、PCRサーマルプログラムなどの実験の詳細を示すウィンドウが表示されます。
      注:品質管理(QC)とデータ分析は、マイクロ流体RT-qPCRプラットフォームに接続されたコンピューター上で、またはフラッシュドライブまたはその他の手段 を介して .bmlファイルを別のコンピューターに転送することによって実行できます。
  2. 以下で説明するように、サンプル設定を定義します。
    注:このステップでは、品質管理(QC)およびデータ分析手順用のサンプルおよびアッセイ(qPCRプライマー)のラベルテンプレートを作成します。
    1. [チップ エクスプローラ]>[サンプル プレート設定]を選択し、新しいサンプル プレートを作成します。適切な容器タイプと容器フォーマットを選択します(この代表的な実験で使用した96ウェルプレートの場合はSBS96)。
    2. 実験計画に従ってサンプル ラベルをソフトウェア スプレッドシートに貼り付け、[タスク] メニューから [ マップ ] を選択します。 SBS96-Left.dsp を選択します。これで、サンプルのセットアップがマップされました。 [詳細ビュー] > [分析] を選択して、 ファイル内のこれらの変更を更新します。
      注意: このソフトウェアで行われた変更は、[ 分析 ]ボタンをクリックするまで保存されません。
  3. ソフトウェアで制御サンプルを定義します。コントロールサンプルのセルを選択するには、左クリックしたまま、選択するセルをドラッグします。個々のセルは、Ctrlキーを押しながら個々のセルをクリックすることで選択できます。RNA標準サンプル(希釈系列)の場合は、サンプル名と使用するRNA濃度を入力します。[ 分析 ]をクリックして保存します。
  4. 上記のステップ8.2と同様に検出器のセットアップを定義しますが、RT-qPCRアッセイ名、つまりアッセイする遺伝子の名前を使用します。 検出器プレートのセットアップ を選択し、新しいアッセイプレートを作成します。適切な容器タイプとフォーマットを選択します(96ウェルプレートの場合はSBS96)。実験デザインに従ってアッセイ名を貼り付け、 分析 をクリックして保存します。
  5. 以下に説明するように、ユーザー品質管理(QC)プロセスを開始します。
    注:この代表的な実験では、サイクルタイム(Ct)閾値化法を使用しました。つまり、ソフトウェア(自動グローバル)または手動(ユーザーグローバル)によって定義されたしきい値信号に達しなかったサンプルは、失敗した反応と見なされ、データセットに含まれません。
    1. [タスク フレーム>分析ビュー] を選択します。分析設定ペインで、設定を [自動グローバル] (チップ全体に適用されるしきい値を自動的に計算する) または [ユーザー グローバル] に変更します。ベースライン補正を線形微分に設定します。User Global を使用する場合は、代表的な実験と同様に、失敗しきい値を手動で決定する必要があります。
    2. この代表的な実験では、次のようなQCルールを使用しました:個々のアッセイまたはサンプルの失敗率が70%以上の場合、データセットのその行または列全体が失敗しました。
    3. 96 x 96チップの各反応を手動で確認します。増幅曲線と融解曲線を視覚化して、各反応が予想されるqPCRパターンに従っているかどうかを判断します。増幅曲線または融解曲線が予想と一致しない場合は、その反応に失敗します。
  6. QC に続いて、[ ファイル] > [エクスポート] を選択してデータをエクスポートし、データセットを.csvファイルとして保存します。
  7. エクスポートされた.csvファイルには、合格/不合格行列と生の Ct 値を持つ行列の両方が含まれているため、データセットを削除します。合格-不合格行列を使用して、データセット内の失敗したセルをNAに置き換えます。
  8. オープンソースの R ソフトウェアの最新バージョンをダウンロードし、R-Studio アプリケーションをダウンロードします。正規化されたデータセットを R にアップロードします。 スタディに適合するようにデータを分析します。
  9. 以下で説明するように、-ΔΔCt メソッドを使用してデータセットを正規化します。
    注:中央値センタリングまたはハウスキーピング遺伝子正規化をサンプル行全体で使用して、-ΔCt 値を生成できます。代表的な実験では、中央値センタリングが使用され、ハウスキーピング遺伝子正規化によって検証されました。これは、.csv形式で、またはデータ分析ソフトウェアにアップロードすることによって行うことができます。
    1. 中央値センタリングの場合は、個々のサンプル(10セルプール)のすべてのCt値から計算された中央値のCt値を計算します。次に、この中央値からすべての個々のCt値を減算します。これにより、-ΔCt 値が得られます。
    2. ハウスキーピング遺伝子の正規化では、各サンプルのハウスキーピング遺伝子(代表的な実験ではActb、 Gapdh、 およびLdha )の平均発現を計算し、この値を個々のCt値を減算する値として使用します。
    3. -ΔΔCT値を生成するには、各アッセイカラムの中央値を取り、-ΔCct値を含みます。各−ΔCt値からアッセイ中央値を減算して、−ΔΔCt値を生成する。
  10. R のスケール関数を使用して、各 -ΔΔCt 値の Z スコアを計算します。 R ヒート マップ関数または別のソフトウェアを使用してヒート マップを生成します。
  11. ピアソン相関関数を使用して、各遺伝子間のピアソン相関を計算します。R で melt 関数を使用して、他の機能のためにデータセットを整理します。このデータをエクスポートし、遺伝子相関ネットワークソフトウェアにアップロードします。

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Representative Results

単一細胞収集の検証は、LCM手順中に視覚的に実行されます。細胞核はQCステーションで評価されます。細胞型は、その細胞型およびその一般的な形態に対するタグ付き蛍光色素の放出によって決定できます。キャップ上で望ましくない細胞が選択されている場合、それらの遺伝物質はQCステーションでUVレーザーで破壊される可能性があります。分子分析によるさらなる検証も必要です。この代表例16では、ミクログリアに加えて、チロシンヒドロキシラーゼ(Th)陽性(+)およびTh陰性(-)の2種類のニューロンを選択した。図1Dは、ニューロンを意図したサンプルが、ニューロンマーカーであるNeuNの統計的に有意な発現上昇を示したことを示しています。同時に、ミクログリアサンプルはミクログリアマーカーCD34およびCx3xr1の有意な上昇を示し、サンプル選択が高い忠実度で行われたことを示唆しています。さらに、Th+ニューロンサンプルは、Th-ニューロンサンプルおよびミクログリアサンプルと比較して有意に上昇したTh発現を示し、Th-ニューロンはGCG(プレプログルカゴンコード遺伝子)の有意な発現上昇を示し、これらのTh-ニューロンサンプルはGLP-1を神経伝達物質として使用するニューロンで濃縮されていることを示唆しています(図1D).線形判別分析として知られるよりグローバルな計算尺度は、これら3つの細胞タイプが、ニューロンとミクログリアがx軸に沿って分離し、Th+およびTh-ニューロンサンプルがy軸に沿って分離して測定された65個の遺伝子すべてで異なる遺伝子発現プロファイルを有することを示しました(図1E)。

データの品質は、バッチ内およびバッチ間の技術反復でも検証されました(図2 および 図3)。バッチ内は、その特定のバッチからのデータ品質の制御をレプリケートします。バッチ内反復が整列しない場合は、最初のバッチを実行するために作成されたのと同じサンプルとアッセイプレートから別のqPCRチップ実験を実行できます。バッチ間レプリケートにより、バッチ間のデータを比較できます。これは、この代表的な例のように複数のバッチを必要とする多数のサンプルをアッセイする実験にとって非常に重要です。この実験では、バッチ4のサンプル40として1つの外れ値がありました(図3)。しかし、バッチ1、2、および3のサンプル40は正しく整列し、バッチ4の他の反復はバッチ1、2、および3に整列しており、これはこの1回の反復で発生した孤立した不良反応であることを示唆しています。バッチ間で比較するには、適切なデータ正規化手法も必要です。この実験では中央値センタリングを使用しましたが、ハウスキーピング遺伝子(Actb、 Gapdh、 Ldha)もこの実験でアッセイされ、中央値センタリング法のコントロールとして機能しました。つまり、どちらの方法でも、非常に類似したデータセットが生成され、さらに高いデータ品質が示唆されました。

図4 は、細胞サブ表現型によって編成された GLP-1 濃縮ニューロンサンプルのヒートマップを示す。この図は、神経生物学における細胞サブ表現型の重要性を示すだけでなく、アルコール離脱によってサブ表現型の比率がどのように変化するかも示しています。ヒートマップは、炎症性遺伝子クラスター1を高度に発現するサブ表現型Aが、8時間Wdの時点で比率が増加し、32時間Wdで最大に達することを示しています。176時間Wdまでに、この炎症性サブ表現型は、その有病率を正常化して制御に戻している。 GABAR 遺伝子クラスター2を高発現するサブフェノタイプBは、176時間Wd条件によるこの遺伝子クラスターの発現の全体的な抑制を示す。これらの知見は、このGLP-1ニューロン細胞型が、アルコール離脱時に炎症性亜フェノイプを増加させると同時にGABAサブフェノタイプにおける GABAR の発現レベルを低下させることによって、どのように興奮過敏になるかを示しています。 図5 は、個々のサンプルの遺伝子発現を平均に結合して、遺伝子のクラスターの発現とその遺伝子転写産物のタンパク質の位置を時系列全体で視覚化できるようにします。

Figure 1
図1:実験計画と単一細胞選択。 (a)ラットトリプレットは、5つの治療条件のうちの1つに無作為に割り付けられた。(B)シングルセルトランスクリプトームデータの生成。(C)アッセイされた遺伝子とその機能の漫画的表現。緑色の遺伝子はアッセイしなかった。公式の遺伝子記号が使用されます。(D)細胞型マーカーの遺伝子発現。エラーバーは標準エラーを示します。ミクログリアと比較したニューロン、p値= 0.0273、3.94 x 10-10、7.73 x 10-12。Th+ニューロンは、Th-ニューロン(p = 4.56 x 10-11)およびミクログリア(p = 2.95678 x 10-15)と比較して上昇したTh発現を示した。Th−ニューロンは、Th+ニューロン(p=0.0106)およびミクログリア(p=0.0435)と比較してGCGの発現上昇を示し、それらがGLP-1+ニューロンであることを示している。*p < 0.05, ***p < 4 x 10-10.(E)すべてのサンプルの線形識別分析は、2次元空間で収集された3つの細胞タイプ間で測定されたすべての遺伝子の差を表示します。NEニューロンとGLP-1ニューロン間の重心距離= 3.30、NEニューロンとミクログリア= 1.57、GLP-1ニューロンとミクログリア= 2.92。この図は、O'Sullivanら202116から修正されています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 2
図2:バッチ内の生のCt値のテクニカルレプリケートプロット。各グラフには、チップ内の技術反復の生のCt値が互いにプロットされて表示され、技術的な実験の完全性を示しています。この図は、O'Sullivanら202116から修正されています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 3
図3:バッチ間の生のCt値のテクニカルレプリケートプロット。 各グラフには、チップ間のテクニカルレプリケートの生のCt値が互いにプロットされて表示され、すべてのバッチが互いに比較可能であることが示されます。この図は、O'Sullivanら202116から修正されています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 4
図4:GLP-1濃縮ニューロンサンプルのヒートマップ。ヒートマップは、アルコール離脱時系列を通じてGLP-1濃縮ニューロンサンプルの細胞サブ表現型を表示します。行は、大文字でラベル付けされた細胞サブ表現型クラスターを持つ10セルプールサンプルを表します。列は、そのサンプル中のその遺伝子の-1〜+1カラースケールでの-ΔΔCt遺伝子発現値のzスコアを表す。遺伝子クラスターは番号で標識されています。この図は、O'Sullivanら202116から修正されています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 5
図5:GLP-1濃縮ニューロンサンプルにおけるスフェノタイプ遺伝子発現。細胞図は、図4のヒートマップに示されているサブ表現型の相対遺伝子発現(-ΔΔCT値の平均zスコア)を表すボックスを表示します。ダイアグラムはCytoscapeバージョン3.8.0を使用して構築され、zスコアはRバージョン3.5.2のスケール関数を使用して計算されました。右側の-ΔΔCt標識は、どのボックスがどの遺伝子に対応するかを示し、色は発現を表す(青色は低発現、黄色は高発現)。ボックスの位置は、その遺伝子転写産物からのタンパク質産物の局在または機能を表す。緑色の数字は、サブ表現型内のサブグループを示します。この図は、O'Sullivanら202116から修正されています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 6
図6:内受容感覚迷走神経回路、内臓感情神経、および依存症の対戦相手プロセスモデルの概略図。 (A)内受容感覚迷走神経求心性は、腸内細菌叢やその他の末梢器官の影響を強く受ける腸の状態を孤立核(NTS)に中継します。この情報はその後扁桃体に中継され、感情状態に影響を与えます。(B)感情、ストレス、自律神経調節における孤立核(NTS)と扁桃体の中心核(CeA)の統合的な役割を示す簡略化された漫画表現。GLP-1ニューロンとNEニューロンの2つのニューロンサブタイプが強調表示されています。多くの解剖学的および機能的接続は、わかりやすくするために省略されています。略語:NE =ノルエピネフリン;GLP-1=グルカゴン様ペプチド1;GABA = γ-アミノ酪酸;HPA軸=視床下部 - 下垂体 - 副腎軸;CRF =コルチコトロピン放出ホルモン。(C)アルコールおよび/またはオピオイド曝露には、中脳辺縁系ドーパミン経路を介して報酬を刺激し、反報酬を阻害する2つの作用があります。これらの行動は、積極的な強化を通じて物質使用を動機付けます。(D)アルコールおよび/またはオピオイド離脱には、中脳辺縁系ドーパミン経路(図示せず)を阻害することによって報酬を阻害し、反報酬を刺激するという2つの作用があります。この研究は、内臓感情神経炎症が反報酬刺激のエンドポイントであることを提案していますが、この仮説はさらなるテストが必要です。これらの行動は、メカニズムが何であれ、負の強化を介して物質依存を動機付けます。この図は、O'Sullivanら202116から修正されています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

補足表1:マイクロ流体RT-qPCR用のプライマー。 mRNA増幅のためのすべてのプライマーペアは、各プライマーペアによって形成されるアンプリコン長とともにリストされています。この表は、O'Sullivanら202116から修正されています。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

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Discussion

アルコール使用障害は依然として治療が困難な疾患です。私たちのグループは、システム神経科学の視点で反報酬プロセスを調査することにより、この障害にアプローチしました。アルコール離脱時系列16における単一NTSニューロンおよびミクログリアの遺伝子発現変化を測定した。NTSは、アルコール離脱症候群で発生する自律神経調節不全におけるその顕著な役割のために選ばれました。LCMとシングルセルマイクロ流体RT-qPCRを組み合わせることで、解剖学的および分子的感度と特異性を備えた堅牢な数のサンプルと遺伝子を低コストで測定できます(図1B-C)。単一細胞を同定し、IHC染色により選択し、これらの細胞サブ表現型群を分子発現で検証した(図1D-E)。しかしながら、いくつかのGLP-1濃縮ニューロン試料(TH−ニューロン)はThを適度に発現した(図4)。細胞表現型の確立は、蛍光可視化に基づく細胞選択時に行われ、この基準は、単一遺伝子Thの発現に基づく分子グループ化が細胞表現型を示唆する発現パターンを定義できなかったため、研究に使用されました16。したがって、結果は、主要なNTSミクログリアおよびニューロンサブ表現型、およびアルコール離脱におけるそれらのダイナミクスを特徴付けます。

この原稿は、単一細胞トランスクリプトミクスの方法を説明しており、プロトコルのすべてのステップが説明されているように従うことが不可欠です。異なる臓器組織または細胞型を扱う場合、いくつかの変更が必要になる場合があります。このプロトコルの課題の1つは、LCM中にRNAの品質と完全性を維持することです。IHC染色、LCM、およびマイクロ流体RT-qPCRのプロトコルを確立し、上記の課題に対処しています。簡単に言うと、これらのプロセスには、RNA分解を防ぐためのすべての染色溶液へのRNase阻害剤の添加、RNA分解の可能性を防ぐための高速染色プロトコル、IHC染色および脱水の直後にLCM用のスライドを処理し、サンプル処理または転送中に可能な限り適切な低温条件を維持することが含まれます。

トランスクリプトミクスアッセイは、RNA単離なしで溶解した単一細胞に対して実行され、その後、逆転写、事前増幅、およびqPCRが行われます。事前増幅ステップは、qPCRのためにcDNA分子を検出可能なレベルまで選択的に増幅することです。プリアンプリフィケーションステップにはいくつかの制限があります。これらには、増幅に失敗した遺伝子転写物が含まれ、マイクロ流体RT-qPCRでは検出されません。PCR反応には実験アッセイ用のすべてのプライマーが含まれているため、プライマーダイマー形成の可能性もあります。すなわち、単一のプライマー対の順方向および逆方向の配列、ならびに実験における全ての順方向および逆方向の配列を有する二量体の形成が可能である。したがって、RNA標準のようなポジティブ実験コントロールを使用したプライマーテストが推奨されます。

RT-qPCRチップの設計は、品質管理とバッチ効果のためのこのプロトコルのもう一つの重要な側面です。ポジティブコントロールは、アッセイされる動物および器官(この代表例ではラット脳)からの標準的なRNAからなる。その後、RNA希釈シリーズを各チップにロードすることができ、アッセイされた各遺伝子に対して適切な定量的シグナルを実証する必要があります。水はネガティブコントロールとして使用できます。これらの制御は、異なるチップからのデータを組み合わせるときに発生する可能性のあるバッチ効果を制御する適切な正規化に不可欠です。これについては、手順 8 で詳しく説明します。

ここに示す代表的な実験では、これらの手法を仮説作成と可能なメカニズムへの洞察を提供するために適用しました。この研究は別の研究の文脈で実施され、傍受的反報酬仮説13に重要な情報を提供します。簡単に言えば、このモデルは、迷走神経からNTS を介して 扁桃体への内受容感覚シグナル伝達によって物質の離脱において反報酬が刺激され、この反報酬の最初の基質は神経炎症であると推測しています(図6)。この研究は、アルコール離脱時のニューロンとミクログリアの遺伝子発現の炎症性変化を確立することにより、この仮説を支持しています。

この研究の主な弱点は、機構論的な主張がないことです。ただし、これらの方法は、このようなベースライン実験を実行した後にメカニズムを決定するために使用できます。例えば、横隔膜下迷走神経切開術や遺伝子ノックアウトなどの動物モデルの介入または摂動は、炎症調節因子の解剖学的または遺伝的メカニズムを実証することができる。このアプローチを採用した将来の研究は、依存症治療の臨床診療にこれらの洞察を実装することを目的とした内受容感覚的反報酬仮説の開発に貢献する可能性があります。

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Disclosures

著者は、競合する経済的利益はないと宣言しています。

Acknowledgments

ここで紹介する研究は、JSとRVに授与されたNIH HLB U01 HL133360、JSとEVBに授与されたNIDA R21 DA036372、SJO'Sを支援するためにJan Hoekに授与されたT32 AA-007463、および国立アルコール依存症およびアルコール乱用研究所:R01 AA018873。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
20X DNA Binding Dye Fluidigm 100-7609 NA
2x GE Assay Loading Reagent Fluidigm 85000802-R NA
96.96 Dynamic Array IFC for Gene Expression (referred to as qPCR chip in text) Fluidigm BMK-M-96.96 NA
Anti-Cd11β Antibody Genway Biotech CCEC48 Microglia Stain
Anti-NeuN Antibody, clone A60 EMD Millipore MAB377 Neuronal Stain
Anti-tyrosine hydroxylase antibody abcam ab112 Stain for TH+ neurons
ArcturusXT Laser Capture Microdissection System Arcturus NA NA
Biomark HD Fluidigm NA RT-qPCR platform
Bovine Serum Antigen Sigma-Aldrich B4287
CapSure Macro LCM Caps ThermoFisher Scientific  LCM0211 NA
CellDirect One-Step qRT-PCR Kit ThermoFisher Scientific 11753500 Lysis buffer solution components
CellsDirect Resuspension & Lysis Buffer Kit ThermoFisher Scientific 11739010 Invitrogen
DAPI ThermoFisher Scientific 62248 Nucleus Stain
DNA Suspension Buffer TEKnova T0221
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) ReadyProbe Secondary Antibody, Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) ReadyProbe Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 ThermoFisher Scientific R37118 Seconadry Antibody
Exonuclease I New Englnad BioLabs, Inc. M0293S NA
ExtracSure Sample Extraction Device ThermoFisher Scientific LCM0208 NA
FisherbrandTM Superfrost Plus Microscope Slides ThermoFisher Scientific 22-037-246 Plain glass slides
GeneAmp Thin-Walled Reaction Tube ThermoFisher Scientific N8010611
Goat anti-Mouse IgG (H+L), Superclona Recombinant Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 ThermoFisher Scientific A28180 Seconadry Antibody
IFC Controller Fluidigm NA NA
RNaseOut ThermoFisher Scientific 10777019
SsoFast EvaGreen Supermix with Low Rox Bio-Rad PN 172-5211 NA
SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit ThermoFisher Scientific 11754250 Contains VILO and SuperScript
T4 Gene 32 Protein New Englnad BioLabs, Inc. M0300S NA
TaqMan PreAmp Master Mix ThermoFisher Scientific 4391128 NA
TE Buffer TEKnova T0225 NA
TempPlate Semi-Skirted 96-Well PCR Plate, 0.2 mL USA Scientific 1402-9700 NA

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References

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神経科学、第186号、シングルセル遺伝子発現、レーザーキャプチャーマイクロダイセクション、マイクロ流体qPCR、依存症、内臓感情神経、神経炎症、反報酬
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O'Sullivan, S. J., Srivastava, A., Vadigepalli, R., Schwaber, J. S. Investigating Drivers of Antireward in Addiction Behavior with Anatomically Specific Single-Cell Gene Expression Methods. J. Vis. Exp. (186), e64014, doi:10.3791/64014 (2022).

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