Summary
Lazer yakalama mikrodiseksiyonu ve mikroakışkan RT-qPCR kombinasyonu, tek nöronlarda ve gliada transkriptomun ölçülmesinde anatomik ve biyoteknik özgüllük sağlar. Psikiyatrik hastalığa bir sistemin biyoloji yaklaşımı ile yaratıcı yöntemler uygulamak, bağımlılıkta nöroinflamasyon antireward hipotezi gibi anlayış ve tedavide atılımlara yol açabilir.
Abstract
Bağımlılık davranışlarının artan oranları, ruh sağlığı araştırmacılarını ve klinisyenleri antireward ve iyileşmeyi anlamaya motive etmiştir. Ödül ve başlangıçtan bu uzaklaşma, bağımlılığı araştırmak için uygulanan yöntemlerin genişletilmesiyle birlikte yeni bakış açıları, paradigmalar ve hipotezler gerektirir. Burada bir örnek sunuyoruz: Lazer yakalama mikrodiseksiyonu (LCM) ve yüksek verimli mikroakışkan ters transkripsiyon kantitatif polimeraz zincir reaksiyonlarını (RT-qPCR) birleştiren antireward araştırmak için bir sistem biyolojisi yaklaşımı. Gen ekspresyon ağı dinamikleri ölçüldü ve alkol ve opioid yoksunluğunda nöroviseral disregülasyonun temel itici güçlerinden biri olan nöroinflamasyon tanımlandı. Bu teknoloji kombinasyonu, yüksek verimli duyarlılık ve spesifik gen ekspresyon ölçümleri ile tek hücreli çözünürlükte anatomik ve fenotipik özgüllük sağlar ve hem hipotez üreten veri kümeleri hem de yeni içgörüler ve tedaviler için fırsatlar yaratan mekanik olanaklar sağlar.
Introduction
Bağımlılık, gelişmiş dünyada giderek artan bir zorluk olmaya devam etmektedir 1,2. Büyük bilimsel ve klinik ilerlemelere rağmen, bağımlılık oranları artmaya devam ederken, yerleşik tedavilerin etkinliği en iyiihtimalle sabit kalmaktadır 3,4,5. Bununla birlikte, biyoteknolojideki ilerlemeler ve bilimsel yaklaşımlar, madde bağımlılığının patofizyolojisini daha fazla araştırmak için yeni yöntem ve hipotezlere yol açmıştır 6,7,8. Nitekim, son gelişmeler, yeni kavramların ve tedavi paradigmalarının sosyal, ekonomik ve politik sonuçları olan atılımlara yol açabileceğini göstermektedir 9,10,11,12.
Alkol ve opioid bağımlılığının geri çekilmesinde antireward 13,14,15,16'yı araştırdık. Yöntemler bu paradigmanın merkezindedir17,18. Lazer yakalama mikrodiseksiyonu (LCM), yüksek anatomik özgüllüğe sahip tek hücreleri seçebilir. Bu işlevsellik, nöroinflamasyon antireward hipotezinin ayrılmaz bir parçasıdır, çünkü hem glia hem de nöronlar aynı hayvandaki aynı nöronal alt çekirdekten toplanabilir ve analiz edilebilir 13,14,15,16,19. Seçilen hücrelerin transkriptomunun ilgili bir kısmı daha sonra yüksek verimli mikroakışkan ters transkripsiyon kantitatif polimeraz zincir reaksiyonları (RT-qPCR) ile ölçülebilir ve hesaplamalı analiz için yüksek boyutlu veri kümeleri sağlayarak fonksiyonel ağlara ilişkin içgörüler sağlar20,21.
Belirli bir beyin çekirdeğindeki nöronlarda ve glia'da transkriptomun bir alt kümesinin ölçülmesi, hem örnek sayısında hem de ölçülen genlerde sağlam ve hassas ve spesifik olan bir veri kümesi oluşturur. Bu araçlar, bir sistemin psikiyatrik hastalığa sinirbilim yaklaşımı için en uygunudur, çünkü glia, özellikle astrositler ve mikroglia, son on yılda nörolojik ve psikiyatrik hastalıklarda merkezi bir rol oynamıştır22,23. Yaklaşımımız, glia ve nöronların eksprese tepkisini, lokal parakrin sinyallemede yer alan çok sayıda reseptör ve ligandda eşzamanlı olarak ölçebilir. Gerçekten de, sinyalleme, bulanık mantık24 gibi çeşitli nicel yöntemler kullanılarak bu veri kümelerinden çıkarılabilir. Ayrıca, nöronlarda veya glia'da hücresel subfenotiplerin tanımlanması ve işlevleri, belirli çekirdeklerdeki beyin hücrelerinin tek hücre düzeyinde nasıl organize olduğu, tepki verdiği ve düzensizleştirildiği hakkında fikir verebilir. Bu fonksiyonel sistemin dinamikleri zaman serisi deneyleri ile de modellenebilir16. Son olarak, hayvan modelleri, bu sistemin yaklaşımına mekanik bir durum kazandırmak için anatomik veya farmakolojik olarak bozulabilir.
Temsili deney:
Aşağıda, bu yöntemlerin uygulanmasına bir örnek sunuyoruz. Bu çalışmada, alkol bağımlılığı ve ardından geri çekilmeye yanıt olarak soliter çekirdekteki (NTS) sıçan nöronal ve mikroglia gen ekspresyonu araştırılmıştır16. Sıçan kohortları 1) Kontrol, 2) Etanol bağımlı (EtOH), 3) 8 saat geri çekilme (Wd), 4) 32 saat WD ve 5) 176 saat Çar (Şekil 1A) 'dan oluşuyordu. Hızlı dekapitasyonu takiben, beyin sapları ön beyinden ayrıldı ve kriyoseksiyona uğradı ve dilimler tirozin hidroksilaz pozitif (TH +) nöronlar ve mikroglia için boyandı (Şekil 1B). LCM, hem TH+ hem de TH- nöronlarını ve mikrogliayı toplamak için kullanıldı. Tüm hücreler NTS'dendi ve 10 hücreli havuzların örnekleri olarak analiz edildi. RT-qPCR platformunda 65 geni ölçen dört adet 96 x 96 mikroakışkan RT-qPCR dinamik dizisi çalıştırıldı (Şekil 1B-C). Veriler -ΔΔCt yöntemi kullanılarak normalleştirildi ve R kullanılarak analiz edildi ve tek hücreli seçim moleküler belirteçlerle doğrulandı (Şekil 1D-E). Teknik doğrulama, tek bir parti içinde ve partiler arasında analiz edilen teknik replikalarla daha da doğrulanmıştır (Şekil 2 ve Şekil 3). TH+ ve TH- nöronları, benzer inflamatuar gen kümeleri ile farklı alt fenotipler halinde organize olmuş, ancak farklı γ-aminobütirik asit (GABA) reseptörü (R) kümeleri ( R ) ( Şekil 4 ve Şekil 5 ). İnflamatuar gen kümelerinin ekspresyonunu yükselten alt fenotipler 32 saat Çar'da aşırı temsil edilirken, GABA-reseptör (GABAR) ekspresyonu uzun süreli alkol yoksunluğunda (176 h Wd) düşük kalmıştır. Bu çalışma, yoksunlukta visseradan gelen önleyici geri bildirimin, viseral-duygusal nöronal çekirdeklerin (yani, NTS ve amigdala) düzensizliğine katkıda bulunduğunu ve madde bağımlılığına katkıda bulunan daha şiddetli otonomik ve duygusal sekellere neden olduğunu varsayan alkol ve opioid bağımlılığının antireward hipotezine katkıda bulunur (Şekil 6).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu çalışma, Thomas Jefferson Üniversitesi Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi'nin (IACUC) önerileri doğrultusunda gerçekleştirilmiştir. Protokol Thomas Jefferson Üniversitesi IACUC tarafından onaylandı.
1. Hayvan modeli
- Ev erkeği Sprague Dawley (>120 g, Harlan, Indianapolis, IN, ABD) sıçan üçüzleri ayrı ayrı etanol-chow (2 sıçan) veya kontrol-chow karışımına (1 sıçan) serbest erişim.
NOT: Bu temsili deney, alkol yoksunluğunun nörobiyolojisini incelemek için Lieber-DeCarli protokolünü kullandı25,26. Sıçan üçüzleri, aynı sayıda kaloriyle beslenecek üç sıçanlı bir kohorttan oluşur, ancak fedakarlıkta çalışmanın farklı kollarında sona erer. Bu çalışma için üç kol şunlardır: 1) Kontrol, 2) Etanol bağımlı (EtOH) ve 3) Geri çekilme (Wd) (Şekil 1A). Bu çalışmada üç alkol yoksunluk zaman noktası olduğu için toplam beş koşul vardır (Şekil 1A).- Her gün, Wd sıçanı tarafından tüketilen etanol-chow karışımını ölçün ve aynı miktarda etanol karışımı ile tüketilen miktarı EtOH sıçan besleyicisine değiştirin. Eşdeğer kalorili miktarda kontrol karışımını Kontrol sıçanının besleyicisine ekleyin.
NOT: Ortalama günlük etanol tüketimi3 hafta 26'dan sonra 12-16 g / kg civarındadır. - Stabil uzun süreli etanol tüketimi ve bağımlılığını (>5 hafta) takiben, gıda kabını boşaltarak ve kontrol karışımı ile doldurarak Wd sıçanında akut alkol çekilmesine neden olur. Bunu, üç sıçanın da aynı sirkadiyen zaman noktası21'de kurban edileceği şekilde gerçekleştirin.
- Önceden seçilen zaman noktasında, üçlüdeki üç sıçanı da aynı zaman noktasında (Control, EtOH ve Wd) feda edin.
- Her gün, Wd sıçanı tarafından tüketilen etanol-chow karışımını ölçün ve aynı miktarda etanol karışımı ile tüketilen miktarı EtOH sıçan besleyicisine değiştirin. Eşdeğer kalorili miktarda kontrol karışımını Kontrol sıçanının besleyicisine ekleyin.
2. Numune toplama
- Beyni, uygun Wd zaman noktasında (8 saat, 32 saat, 176 saat) her sıçan üçlüsü için aynı sirkadiyen zaman noktasında hasat edin.
- RNA bütünlüğünü korumak için taze dokunun hızlı soğutulması için bir metanol ve kuru buz banyosu hazırlayın. Kenara koyun.
- Sıçanı, azalmış solunum hızı ve motor aktivitenin yokluğu ile belirtildiği gibi, ~ 30 s veya bilinç kaybı meydana gelene kadar izofluran tankına (oksijende% 5) koyun. Sıçan kafasını hızla kesmek için uygun şekilde keskinleştirilmiş bir giyotine koyun.
- Forseps kullanarak beyni parçalamak için hayvanın kafatasını açın. Beyinciği taze beyinden elde tutulan bir tıraş bıçağı ile brüt dilimleyerek çıkarın ve atın. Enine kesi ile beyin sapını ön beyinden dilimleyin.
NOT: Elde taşınan bir tıraş bıçağı, deneysel tasarıma göre ön beyni veya beyin sapını sol ve sağ yarımkürelere hemi-sekt etmek için daha fazla kullanılabilir. Örneğin, bir yarımküreden elde edilen bulguları farklı yöntemlerle doğrulamak için, sol-sağ ayrışmasını araştırın veya örnek sayısını artırın. - Doku gömme kalıbına optimum kesme sıcaklığı (O.C.T.) orta ila yaklaşık 3-4 cm derinlik ekleyin, böylece doku numunesi tamamen daldırılabilir. Dokuyu, ön beyni ve / veya beyin sapını, doku gömme kalıbına yerleştirin ve doku örneğini tamamen örtmek için daha fazla O.C.T. ekleyin.
- Doku örneğini (sıçan ön beyni) içeren plastik doku gömme kalıbını, doku örneğini hemen dondurmak için kuru buz ve metanol soğutma banyosuna ekleyin. Gömme kalıbındaki doku örneğinin, doku toplama tamamlanana kadar soğutma banyosunda kalmasına izin verin, ancak 15 dakikadan uzun olmamalıdır.
NOT: Metanolün doku kabına dökülmesini önlemek için dikkatli olun. - Doku örneklerini -80 °C'de hızla saklayın.
NOT: Mikroakışkan RT-qPCR, mRNA transkriptlerini yükselterek ve ölçerek gen ekspresyonunu ölçer. Bu transkriptler nispeten kararsızdır, bu nedenle mRNA bozulmasını önlemek için numuneyi mümkün olduğunca soğuk tutmak için bu süreçte birçok adım atılır.
3. Kriyoseksiyon
NOT: Bir sıçan nöronal çekirdeği yaklaşık 10 μm'dir. Bu nedenle, 10 μm bu hayvan modeli için en uygun dilim kalınlığıdır. Dilim kalınlığı, çalışma için hayvan modeline göre ayarlanır.
- -80 °C dondurucudan, dondurulmuş beyin sapı içeren doku gömme kalıbını çıkarın ve numuneyi 5-10 dakika boyunca kriyostatta -20 °C'de çözün. Bu donma çözülmesini mRNA koruması için sadece bir kez -20 °C'ye kadar gerçekleştirin.
- Elde taşınan bir tıraş bıçağı ile, plastik gömme kalıbının köşelerini dikey olarak kesin. O.C.T.'ye gömülü beyin sapını plastik doku gömme kalıbından çıkarın. -20 ° C'de ayarlanmış kriyostatın mandren üzerinde, koronal kriyoseksiyon için beyin sapını rostralden kaudal yöne monte etmek için bir yapıştırıcı olarak oda sıcaklığında sıvı O.C.T. kullanın.
- Rostraldeki 10 μm koronal kriyoseksiyonları, ilgilenilen bölgeyi (NTS) içeren bölümlere ulaşılana kadar sıçan beyin sapından kaudal yöne doğru kesin. Bu kriyozitlerin yüksekliği ve genişliği, plastik gömme kalıbının boyutlarına bağlı olarak ~ 200 mm'dir.
- NTS'yi veya çalışmaya dayanan diğer ilgi alanlarını içeren beyin sapı dokusunun 10 μm kriyoseksiyonlarını, oda sıcaklığındaki düz cam slaytlara çözerek toplayın. Hızlı bir şekilde, bu slaytları kesitli olarak kuru buzun üzerine yerleştirilmiş bir soğutma metali tavasına yerleştirin. En kısa sürede, kriyoseksiyon içeren cam slaytları depolama için -80 °C dondurucuya yerleştirin.
NOT: Tek bir cam slayt, genişlik ve yükseklik ~ 200 mm olduğu için birden fazla 10 μm kriyoseksiyona sığabilir. Böylece, aynı slayt, farklı hücre tipleri için boyanmış kriyoseksiyonlar içerebilir.- Slaytta birkaç bölüm olduğunda, bunların 100 mm boş alanla ayrıldığından emin olun. Kriyoseksiyonlar arasında bir sınır oluşturmak için, hidrofobik bir kalem kullanın. Bu, farklı antikor çözeltilerinin aynı cam slayt üzerinde farklı hücre tipleri için lekelenmesini sağlar. Cam kızağın kenarından kriyoseksiyon için 20 mm boşluk bırakın.
4. Tek hücrelerin immünofloresan boyanması
- LCM kullanılarak toplanmak üzere istenen beyin hücresi tiplerini (nöronlar, mikroglia, astrosit vb.) etiketlemek için beyin kriyöstrlerinde hızlı boyama immünofloresan protokolünü kullanın.
NOT: Bu deneyler için kullanılan immünohistokimya boyama protokolü, bu işlem sırasında aşırı mRNA bozunmasını önlemek için hızlı olacak şekilde tasarlanmıştır.- -80 °C dondurucudan, NTS içeren sıçan beyin sapının 10 μm kriyoseksiyonlarını içeren cam slaytları çıkarın. Kriyoseksiyonlu dokuyu sabitlemek için 30 sn'lik slaytları %75 etanol banyosuna batırın. Fazla sıvıyı çıkarın.
- Sabit kriyoseksiyonlu beyin sapı dokusuna, antikorların hedeflenmemiş bağlanmasını engellemek için 30 s fosfat tampon salin (PBS) içinde% 2 Sığır Serum Albümini (BSA) uygulayın. Daha sonra PBS ile yıkayın.
- Kriyoseksiyonlu dokuyu örtmek için yeterli miktarda birincil antikor çözeltisi uygulayın (şimdi sabitlenmiş ve bloke edilmiştir). Doku bölümünü 2 dakika boyunca birincil antikor çözeltisinde inkübe edin. Dokuyu bir kez% 2 BSA çözeltisi ile yıkayın. Primer antikor çözeltisi, blokaj için BSA-PBS çözeltisinin% 96'sını,% 3 primer antikor ve% 1 RNaz inhibitörünü içerir. Primer antikor 1:25 oranında seyreltildi.
NOT: Bu temsili deneyde, birincil antikorlar anti-NeuN antikoru ve anti-Cd11β antikorundan oluşmaktadır. Nöronlar ayrıca TH+ ve TH- alt gruplarına bölündü, bu nedenle nöronal boyama için birincil antikor çözeltileri BSA PBS çözeltisinin% 93'ünü,% 3'ünü anti-NeuN antikorunu,% 3 anti-tirozin hidroksilaz antikorunu ve% 1'ini RNaz Çıkışını içeriyordu. - Beyin sapı dokusunu örtmek için yeterli miktarda ikincil antikor (1:200) çözeltisi uygulayın. İkincil antikor çözeltisinin dokuyu yıkamasına izin verin. 3 dakika sonra, dokuyu bir kez% 2 BSA çözeltisi ile yıkayın.
NOT: Sekonder antikoru içeren çözelti, 196.5 μL% 2 BSA, hücre tipi için 1 μL keçi anti-fare 555 nm floresan etiketi, TH boyama için 1 μL eşek anti-tavşan Alexa 488 nm, 2.5 μL RNaz inhibitörü ve 1.3 μL DAPI'den (1:10000) oluşmuştur.
5. Standart etanol ve ksilen doku dehidrasyon serisi
- Lekeli kriyoseksiyonlu dokunun 30 sn için% 75'lik bir etanol banyosunda durduğu cam slaytları yerleştirin, ardından 30 s için% 95 etanol banyosuna, 30 s için% 100 etanol banyosuna ve son olarak% 100 etanol'e hem 30 s için (ikinci bir kapta) yerleştirin.
- Etanol dehidrasyon serisini tamamladıktan sonra, iki taze% 100 ksilen banyosu dökün. Ardından, cam slaytları 1 dakika boyunca ilk ksilen banyosuna yerleştirin. Slaytları hızla çıkarın ve 4 dakika boyunca diğer taze ksilen banyosuna yerleştirin.
- Lekeli ve susuz doku kriyokesitleri içeren cam slaytları ksilenlerden çıkarın ve hava kuruması için 5 dakika boyunca karanlık ama havalandırılan bir kaba koyun. Hava kurutmayı takiben, son kurutma için cam slaytları 5 dakika boyunca bir kurutucuya yerleştirin.
6. Lazer yakalama mikrodiseksiyonu (LCM) kullanarak tek hücreleri seçin
- Bende, sabit ve kurutulmuş doku kriyokesitleri içeren cam sürgüyü LCM mikroskop numune tutucusuna yerleştirin. Hücre toplamanın gerçekleşeceği ilgili bölgeyi bulmak için anatomik işaretleri kullanın (bu temsili örnekte NTS).
- Mikroskop floresansını açın ve ilgilendiğiniz lekeli hücre tiplerini bulun. İstenilen hücrenin çekirdeğinin ilgilenilen bölgede olduğundan ve diğer hücrelerin çekirdeklerinden >3 mm'lik bir mesafe ile izole edildiğinden emin olun. LCM yazılımını kullanarak toplamak için bir hücreyi (deney gerçek tek hücreliyse) veya birden fazla hücreyi (deney, bu temsili deneyde gösterildiği gibi havuzlanmış tek hücreli örnekleri [yani, tek hücreli ölçek] gerektiriyorsa) tanımlayın ve işaretleyin.
NOT: Bu temsili deneyde 10 hücreli havuzlardan oluşan örnekler kullanılmıştır. Bu, örnekler arasındaki gen ekspresyon değişkenliğini azaltmak ve analiz edilen tek hücre sayısını artırmak için yapılır, ancak bu hala tek hücreli bir ölçek deneyi olarak kalır. Gerçek tek hücre deneyleri bu yöntemle tamamlanabilir20,27. Ek olarak, daha büyük doku kesitleri de seçilebilir21. - İstenilen hücreler seçildikten sonra, LCM robot kolunu kullanın, LCM kapağını işaretli doku kriyüzyonunda ilgilenilen bölgeye yerleştirin.
- Test çekimlerini kullanarak kızılötesi (IR) lazerin yoğunluğunu ve hedeflemesini kalibre edin.
NOT: Bu, her örnek için yapılır. Kalibrasyon, yanlışlıkla deneysel olmayan dokuyu seçmemek için kapağın doğrudan doku üzerinde olmayan bir bölümünde yapılmalıdır.- Yoğunluğu kalibre etmek için, IR lazer atışının süresini, gücünü ve boyutunu ayarlayın, böylece bir atış yalnızca kapak yapıştırıcısını tek bir hücresel çekirdeği seçecek kadar eritir ve ayrıca kapağı slayttaki kriyoseksiyona eritecek kadar güçlüdür. Bu değerler her kapak için farklı olacaktır.
- Lazer artı işaretlerini tam olarak lazerin kapağı erittiği yerde lokalize ederek hedeflemeyi kalibre edin.
- LCM kızılötesi lazeri ateşleyerek tanımlanan hücreleri toplayın ve kapağı bu hücreler üzerindeki kriyoseksiyonlu doku üzerinde eritin. LCM mikroskobunun kalite kontrol (QC) alanına kapağı yerleştirmek için robot kolunu kullanarak doku diliminden yalnızca seçilen hücrelerin kaldırıldığından emin olun. Kapaktaki fazla hücreleri çıkarmak için, ekstra hücrelerin genetik materyalini yok etmek için ultraviyole (UV) lazer kullanın.
- LCM yazılım kamerası ile anatomik özgüllüğü kaydedin. Hücre (ler) in çıkarıldığı kriyoseksiyonlu dokunun bir resmini çekin.
- Bu doku diliminin bregmadan uzaklığını belirlemek için anatomik bir atlas (bu örnekte sıçan ön beyninin atlası) kullanın ve bu bilgiyi Z mesafesi28 olarak kaydedin. Seçilen hücreyi tamamen yerelleştirmek için fotoğraftan X ve/veya Y düzlemindeki konumu belirleyin.
- Eldivenli ellerle, LCM kapağını QC alanından çıkarın. Ardından, numune çıkarma cihazını LCM kapağına sabitleyin. Seçilen hücre(ler)e 5,5 μL lizis tamponu uygulamak için pipet kullanın. Buna artık örnek adı verilir.
NOT: Lizis tamponu çözeltisi, 0,5 μL lizis arttırıcı ile birlikte 5 μL resüsitasyon tamponundan oluşur. - LCM kapağına takılı numune ekstraksiyon cihazına 0,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpü takın. Bu düzenlemeyi, numune ve lizis tamponu plakaya daha yakın olacak şekilde 75 °C'lik bir ocak üzerine yerleştirin. Numunenin 15 dakika ısınmasına izin verin.
- Numuneyi ve lizis tamponunu 0,5 mL mikrosantrifüj tüpünün dibine doğru döndürmek için 0,01-0,02 x g'de düşük hızlı bir santrifüj kullanın. Mikroakışkan qPCR'ye kadar numuneyi -80 °C'de saklayın.
7. qPCR çipini platformda mikroakışkan RT-qPCR üzerinde çalıştırın
- Tek hücreli örnekler için gen ekspresyonunu ölçmek için, aşağıda açıklandığı gibi mRNA ön amplifikasyonu gerçekleştirin.
NOT: Protokol mRNA ekstraksiyonunu içermez, çünkü örnekler mRNA izolasyon adımı sırasında kaybolacak çok düşük miktarda RNA (10 pg) içeren tek hücrelerdir. Tek hücreler lize edilir ve numune kaybını en aza indirmek için doğrudan ters transkripsiyon için devam ettirilir.- 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne test edilen her gen için mRNA qPCR gen primerlerini (ileri ve geri) ekleyerek bir primer havuzu oluşturun. Her astarın son konsantrasyonunun 500 nm olduğundan emin olun. Bu örnek deneydeki primerler Ek Tablo 116'da listelenmiştir.
- Pipet 1 μL 5x cDNA reaksiyonu, 96 delikli bir PCR plakasının her bir kuyucuğuna karışır.
- Tek hücreli numuneleri -80 °C dondurucudan çıkarıp oda sıcaklığında bekleterek kısa bir süre (2-3 dk.) çözülmesine izin verin. 20-30 s. Pipet 5,5 μL'lik her bir tek hücreli numunenin pipetini 96 delikli PCR plakasındaki farklı bir kuyucukta döndürmek için 0,01-0,02 x g'de düşük hızlı bir santrifüj kullanın.
NOT: Her bir kuyucuğa konulacak numune numarası ve tipi bu adıma başlamadan önce belirlenir. - 96 delikli PCR plakası artık cDNA reaksiyon karışımına ve her bir kuyucuğa eklenen tek hücreli bir örneğe sahiptir. cDNA reaksiyon karışımını aktive etmek için bu plakayı 65 ° C'de 1,5 dakika boyunca bir termosikler içine yerleştirin. 4 °C'de 1 dakika boyunca 1.300 x g'de yüksek hızlı santrifüjleme kullanarak içeriği döndürün ve PCR plakasını ıslak buz üzerine koyun.
- PCR plakasındaki her bir kuyucuğun içine, 0.12 μL T4 Gen 32 Protein, 0.73 μL DNA süspansiyon tamponu ve 0.15 μL 10x cDNA sentezi ana karışımından pipet. PCR plakasını termosiklette aşağıdaki protokolden geçirin: 5 dakika boyunca 25 °C, 30 dakika için 50 °C, 25 dakika için 55 °C, 5 dakika için 60 °C, 10 dakika için 70 °C ve 4 °C'de son bir bekletme.
NOT: T4 Gen 32 proteini (tek sarmallı DNA (ssDNA) bağlayıcı protein) bakteriyofaj T4 replikasyonu ve onarımı için gereklidir. T4 Gene 32 proteini, ters transkripsiyonun verimini ve verimliliğini artırmak ve PCR ürün verimini artırmak için protokolün ters transkripsiyon adımında kullanılmıştır. - PCR plakasındaki her bir oyuğa, pipet 7.5 μL Taq polimeraz ana karışımıdır. Bunu takiben, her bir kuyuda, 7.1.1 adımında oluşturulan astar havuzunun 1,5 μL'lik pipeti. PCR plakasını termosiklustaki aşağıdaki lineer ön amplifikasyon adımından geçirin: 10 dakika boyunca 95 °C; 22 döngü: 5 s için 96 °C ve 4 dakika için 60 °C.
- PCR plakasındaki her bir oyuğa, pipet 1.2 μL ekzonükleaz I, 4.2 μL DNA süspansiyon tamponu ve 0.6 μL 10x ekzonükleaz I reaksiyon tamponu. PCR plakasını termosiklette aşağıdaki protokolden geçirin: 30 dakika boyunca 37 °C, 15 dakika boyunca 80 °C.
NOT: Ekzonükleaz, nükleotidlerin lineer tek sarmallı DNA'dan 3' ila 5' yönünde uzaklaştırılmasını katalize eder. Ekzonükleazı, dahil edilmemiş primerlerin ve ön amplifikasyondan sonra mevcut olabilecek tek sarmallı cDNA'ların çıkarılması için numune temizliği için kullanıyoruz. - PCR plakasındaki her bir kuyucuğun içine 54 μL TE tamponu pipetin. PCR plakasının içeriğini döndürmek için 4 °C'de 5 dakika boyunca 1.300 x g'de yüksek hızlı bir santrifüj kullanın.
- Protokolün bir sonraki aşamasına devam etmeyi planlıyorsanız, PCR plakasını 4 ° C'de soğutun. Ön amplifikasyon aşamasının tamamlanması ile mikroakışkan qPCR'nin başlaması arasında 12 saatten fazla bir süre varsa, qPCR plakasını örtün ve -20 °C'lik bir dondurucuya yerleştirin.
- qPCR çipi için örnek plakayı (yeni 96 delikli PCR plakası) aşağıda açıklandığı gibi yapın.
- Adım 7.1'deki ön amplifikasyon PCR plakası -20 °C'lik bir dondurucuya yerleştirildiyse, 10 dakika boyunca oda sıcaklığında çözülmesine izin verin.
- Yeni bir 96 delikli PCR plakasına, her bir kuyucuğa pipet 4.55 μL PCR supermix düşük rox ve 0.45 μL 20x DNA bağlayıcı boya. Daha sonra pipet 3 μL önceden amplifikasyonlu numune PCR plakasından 7.1. adımda yapılır. PCR plakasını döndürmek ve PCR numune plakasını buzun üzerine yerleştirmek için 4 °C'de 5 dakika boyunca 1.300 x g'de yüksek hızlı santrifüjleme kullanın.
- Aşağıda açıklandığı gibi qPCR çipi için bir tahlil plakası (yeni bir 96 delikli PCR plakası) yapın.
- 96 delikli yeni bir PCR plakasına, her bir kuyucuğa 1,25 μL DNA süspansiyon tamponu ve 3,75 μL 2x tahlil yükleme reaktifine pipet yerleştirin. Ardından, karşılık gelen qPCR astarı 10 μM astarın 2,5 μL'sinde pipetleyin. PCR plakasını döndürmek ve PCR test plakasını buzun üzerine yerleştirmek için 4 ° C'de 5 dakika boyunca 1.300 x g'de yüksek hızlı santrifüj kullanın.
- qPCR çipini aşağıda açıklandığı gibi mikroakışkan RT-qPCR platformuna yüklenmek üzere hazırlayın.
NOT: qPCR çipi, mikroakışkan prensipler üzerinde çalışan gerçek zamanlı bir qPCR platformudur. qPCR çipi esas olarak 9.216 (96 x 96) odada kesişen 96 örnek kanalı ve 96 RNA qPCR primer kanalından (yani tahliller) oluşan bir matristir. Bir numune ve belirli bir tahlil, gerçek zamanlı bir qPCR reaksiyonunun meydana geldiği dizinin her odasında birleştirilir. Okuma, kullanılan primerler için eşik döngüsü (Ct) değerleri ve amplifikasyon grafikleri olarak oluşturulur.- Astarlama için qPCR çipine kontrol hattı sıvısı enjekte edin. qPCR çipini mikroakışkan karıştırma cihazına takın. Asal (136x) komut dosyasını seçin ve bu programı çalıştırın.
- Program ~ 45 dakika sonra tamamlandığında, astarlanmış qPCR yongasını çıkarın. Astarlanmış qPCR çipine, PCR numune plakasından gelen reaksiyonun 6 μL'sini qPCR çipindeki ilgili numune kuyusuna pipetin.
- Astarlanmış qPCR çipine, PCR tahlil plakasından gelen reaksiyonun 6 μL'sini qPCR çipindeki karşılık gelen tahlil kuyusuna pipetleyin.
NOT: Numunenin dibinde hava kabarcıkları oluşabilir ve qPCR çipinde analiz kuyucukları oluşabilir, bu da çözeltilerin mikroakışkan kanallara girmesini önleyebilir. qPCR çipini mikroakışkan karıştırma cihazına yerleştirmeden önce bu hava kabarcıklarını patlatmak veya çıkarmak için keskin bir iğne kullanılabilir. - qPCR çipini mikroakışkan karıştırma cihazına takın. Yük karışımı (136x) komut dosyasını seçin ve bu programı çalıştırın.
- qPCR çipini mikroakışkan RT-qPCR platformuna yükleyin.
- Mikroakışkan RT-qPCR platformunu açın ve ampulü ısıtın (~20 dk). qPCR çipini mikroakışkan karıştırma cihazından çıkarın. Koruyucu etiketi qPCR yongasının altından soyun.
- Mikroakışkan RT-qPCR platformunu açın ve qPCR çipini mikroakışkan RT-qPCR platformuna yükleyin. Mikroakışkan RT-qPCR platformunda hızlı 96 x 96 PCR protokolünü (30 döngü) çalıştırın.
- Veri toplama yazılımını başlatın ve Yeni Bir Çalıştırma Başlat'a tıklayın.
- Çip barkodunu doğrulayın ve çip türünü tıklayın - İleri'ye tıklayın. Chip Run dosyasına tıklayın ve veri toplama depolama alanı için dosya konumuna göz atın.
- Uygulama Türü'ne tıklayın ve Gen İfadesi'ni seçin; pasif referans için ROX'u seçin, Tek Prob'u seçin ve prob türü için EvaGreen'i seçin.
- Termal döngü programını seçmek için tıklayın ve Biomark HD: GE Fast 96x96 PCR+Melt v2.pcl dosyasını seçin.
8. Veri analizi
- Aşağıda açıklandığı gibi qPCR yongasından QC analiz yazılımına veri yükleyin.
- Veri analiz yazılımını indirin. Bu aşağıdaki web sitesinde bulunabilir: https://www.fluidigm.com/products-services/software#. Mikroakışkan RT-qPCR deneyini analiz etmek için yazılımı başlatın.
- Yazılım içinde Chip Run'ı açın. Ardından, deneme tarafından oluşturulan ChipRun.bml dosyasını açın. Pasif referans, prob ve PCR termal programı dahil olmak üzere deneysel ayrıntıları içeren bir pencere açılacaktır.
NOT: Kalite kontrol (QC) ve veri analizi, mikroakışkan RT-qPCR platformuna bağlı bilgisayarda veya .bml dosyasının flash sürücü veya başka yollarla farklı bir bilgisayara aktarılmasıyla yapılabilir.
- Örnek kurulumu aşağıda açıklandığı gibi tanımlayın.
NOT: Bu adım, kalite kontrol (QC) ve veri analizi prosedürleri için etiketli bir numune ve tahlil şablonu (qPCR primerleri) oluşturur.- Örnek Plaka Kurulumu> Chip Explorer'ı seçin ve yeni bir örnek plaka oluşturun. Uygun konteyner tipini ve konteyner formatını seçin (bu temsili deneyde kullanılan 96 delikli bir plaka için SBS96).
- Örnek etiketleri deneysel tasarıma göre yazılım elektronik tablosuna yapıştırın ve Görev menüsünden Harita'yı seçin. SBS96-Left.dsp öğesini seçin. Örnek kurulum artık eşlenmiştir. Dosyadaki bu değişiklikleri güncelleştirmek için Ayrıntı Görünümü > Çözümle'yi seçin.
NOT: Bu yazılımda yapılan değişiklikler, Analiz Et düğmesine tıklanana kadar kaydedilmeyecektir.
- Yazılımdaki kontrol örneklerini tanımlayın. Sol tıklatarak kontrol örnekleri için hücreleri seçin ve seçim için hücreler arasında sürüklerken basılı tutun. Tek tek hücreler, Ctrl tuşunu basılı tutarak ve tek tek hücrelere tıklayarak seçilebilir. RNA standart örnekleri (seyreltme serisi) için, numune adını ve kullanılan RNA konsantrasyonunu girin. Kaydetmek için Analiz Et'e tıklayın.
- Yukarıdaki adım 8.2'ye benzer şekilde ayarlanan dedektörü, RT-qPCR tahlil adlarıyla, yani test edilen genlerin adlarıyla tanımlayın. Dedektör Plakası Kurulumu'nu seçin ve yeni bir tahlil plakası oluşturun. Uygun kap tipini ve formatını seçin (96 delikli plaka için SBS96). Tahlil adlarını deneysel tasarıma göre yapıştırın ve kaydetmek için Analiz Et'e tıklayın.
- Kullanıcı kalite kontrol (QC) sürecini aşağıda açıklandığı gibi başlatın.
NOT: Bu temsili deneyde bir döngü süresi (Ct) eşik yöntemi kullanılmıştır. Diğer bir deyişle, yazılım (Auto Global) veya manuel olarak (User Global) tanımlanan bir eşik sinyaline ulaşmayan örnekler başarısız reaksiyonlar olarak kabul edilir ve veri kümesine dahil edilmez.- Görev Çerçevesi> Analiz Görünümü'nü seçin. Çözümleme ayarları bölmesinde, ayarları Otomatik Genel (çipin tamamına uygulanan bir eşiği otomatik olarak hesaplar) veya Kullanıcı Genel olarak değiştirin. Temel düzeltmeyi doğrusal türev olarak ayarlayın. Kullanıcı Genel kullanılırsa, hata eşiği temsili denemede olduğu gibi el ile belirlenmelidir.
- Bu temsili deneyde aşağıdaki gibi bir QC kuralı kullanılmıştır: tek bir tahlil veya numunenin hata oranı %70 veya daha yüksekse, veri kümesindeki tüm satır veya sütun başarısız olmuştur.
- 96 x 96 yongasındaki her reaksiyonu manuel olarak gözden geçirin. Her reaksiyonun beklenen qPCR modelini takip edip etmediğini değerlendirmek için amplifikasyon eğrilerini ve erime eğrilerini görselleştirin. Amplifikasyon veya erime eğrisi beklenenle eşleşmezse, bu reaksiyonu başarısızlığa uğratın.
- QC'yi takiben, Dosya > Dışarı Aktar'ı seçerek verileri dışarı aktarın ve veri kümesini .csv dosyası olarak kaydedin.
- Dışa aktarılan .csv dosyasında hem Başarılı-Başarısız matrisi hem de ham Ct değerlerine sahip bir matris bulunduğundan veri kümesini budayın. Veri kümesindeki başarısız hücreleri NA ile değiştirmek için Başarılı-Başarısız matrisini kullanın.
- Açık kaynaklı R yazılımının en güncel sürümünü indirin ve ardından R-Studio uygulamasını indirin. Normalleştirilmiş veri kümesini R. Etüde uygun şekilde analiz edin.
- Veri kümesini aşağıda açıklandığı gibi -ΔΔCt yöntemini kullanarak normalleştirin.
NOT: Medyan merkezleme veya kat tutma gen normalizasyonu, bir -ΔCt değeri oluşturmak için bir numune satırı boyunca kullanılabilir. Temsili deneyde, medyan merkezleme kullanılmış ve temizlik gen normalizasyonu ile doğrulanmıştır. Bu, .csv formatında veya bir veri analiz yazılımına yüklenerek yapılabilir.- Medyan merkezleme için, tek bir örnek (10 hücreli havuz) için tüm Ct değerlerinden hesaplanan medyan Ct değerini hesaplayın. Ardından, tüm tek tek Ct değerlerini bu medyan değerden çıkarın. Bu, -ΔCt değeri verir.
- Kat hizmetleri gen normalizasyonu için, her örnek için temizlik genlerinin (temsili deneydeki Actb, Gapdh ve Ldha ) ortalama ekspresyonunu hesaplayın ve bu değeri, bireysel Ct değerlerini çıkarmak için bir değer olarak kullanın.
- Bir -ΔΔC t değeri oluşturmak için, artık -ΔCt değerini içeren her tahlil sütununun medyanını alın. Bir -ΔΔC t değeri üretmek için her -ΔCt değerinden tahlil medyanını çıkarın.
- R'deki ölçek fonksiyonunu kullanarak her -ΔΔCt değeri için z-skorlarını hesaplayın.
- Her gen arasındaki Pearson korelasyonlarını hesaplamak için Pearson korelasyon fonksiyonunu kullanın. Veri kümesini diğer işlevler için düzenlemek üzere R'deki eritme işlevini kullanın. Bu verileri dışa aktarın ve bir gen korelasyon ağı yazılımına yükleyin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tek hücreli toplamanın doğrulanması, LCM prosedürleri sırasında görsel olarak gerçekleştirilir. Hücre çekirdekleri QC istasyonunda değerlendirilir. Hücre tipi, bu hücre tipi ve genel morfolojisi için etiketli florofor emisyonu ile belirlenebilir. Kapakta istenmeyen hücreler seçilmişse, genetik materyalleri QC istasyonunda bir UV lazer ile yok edilebilir. Moleküler analiz ile daha fazla doğrulama da gereklidir. Bu temsili örnek16'da, mikrogliaya ek olarak tirozin hidroksilaz (Th) pozitif (+) ve Th negatif (-) olmak üzere iki tip nöron seçildi. Şekil 1D , nöron olması gereken örneklerin, nöronal belirteç NeuN'nin istatistiksel olarak anlamlı yüksek ekspresyonunu gösterdiğini göstermektedir. Aynı zamanda, mikroglial örneklerde CD34 ve Cx3xr1 mikroglial belirteçlerinin belirgin yükselmesi vardı, bu da numune seçiminin yüksek doğrulukla yapıldığını düşündürüyordu. Ek olarak, Th + nöronal örnekleri, Th-nöronal örneklere ve mikroglia örneklerine kıyasla Th'nin anlamlı derecede yüksek ekspresyonunu gösterirken, Th- nöronları, bu Th-nöronal örneklerin GLP-1'i nörotransmitter olarak kullanan nöronlarla zenginleştirildiğini düşündüren GCG'nin (bir preproglukagon kodlama geni) anlamlı derecede yüksek ekspresyonunu göstermiştir (Şekil 1D ). Doğrusal ayrım analizi olarak bilinen daha küresel bir hesaplama ölçüsü, bu üç hücre tipinin, x ekseni boyunca ayrılan nöronlar ve mikroglia ve y ekseni boyunca bölünen Th + ve Th- nöronal örneklerle ölçülen 65 genin tümünde farklı gen ekspresyon profillerine sahip olduğunu göstermiştir (Şekil 1E).
Verilerin kalitesi ayrıca parti içi ve partiler arası teknik replikasyonlarla da doğrulanmıştır (Şekil 2 ve Şekil 3). Toplu iş içi, söz konusu toplu işlemdeki verilerin kalitesi için denetimi çoğaltır. Toplu iş içi çoğaltmalar hizalanmazsa, ilk toplu işlemi çalıştırmak için yapılan aynı numuneden ve tahlil plakalarından başka bir qPCR yonga denemesi gerçekleştirilebilir. Partiler arası çoğaltmalar, toplu işlerdeki verilerin karşılaştırılabilmesini sağlar. Bu, bu temsili örnek gibi birden fazla parti gerektiren çok sayıda numunenin test edildiği deneyler için çok önemlidir. Bu deneyde parti 4'te örnek 40 olarak bir aykırı değer vardı (Şekil 3). Bununla birlikte, 1, 2 ve 3 numaralı gruplardaki örnek 40 doğru şekilde hizalanmıştır ve diğeri 1, 2 ve 3 numaralı partilerle hizalanmış toplu 4'ten çoğaltılır, bu da bunun bu kopyada meydana gelen yalıtılmış bir kötü reaksiyon olduğunu düşündürür. Toplu işler arasında karşılaştırma yapmak da uygun veri normalleştirme teknikleri gerektirir. Bu deneyde medyan merkezleme kullanıldı, ancak temizlik genleri (Actb, Gapdh, Ldha) bu deneyde de test edildi ve medyan merkezleme yöntemi için bir kontrol görevi gördü. Yani, her iki yöntem de yüksek veri kalitesini öneren oldukça benzer veri kümeleri verdi.
Şekil 4 , hücresel subfenotip tarafından düzenlenen GLP-1 ile zenginleştirilmiş nöronal örneklerin ısı haritasını göstermektedir. Bu rakam sadece nörobiyolojide hücresel subfenotiplerin önemini göstermekle kalmaz, aynı zamanda subfenotiplerin oranlarının alkol yoksunluğu yoluyla nasıl değiştiğini de gösterir. Isı haritası, enflamatuar gen kümesi 1'i yüksek oranda eksprese eden subfenotip A'nın, 8 saatlik Wd zaman noktasında oranın arttığını ve 32 saat Wd'de maksimuma ulaştığını göstermektedir. 176 saat wd ile, bu inflamatuar subfenotip, prevalansını tekrar kontrole normalleştirmektedir. GABAR gen kümesi 2'yi yüksek oranda eksprese eden subfenotip B, bu gen kümesinin ekspresyonunda 176 h Wd koşulu ile genel bir baskılanma olduğunu göstermektedir. Bu bulgular, bu GLP-1 nöronal hücre tipinin, enflamatuar subfenoypunu artırarak ve aynı zamanda alkol yoksunluğu sırasında GABA subfenotipindeki GABAR'ların ekspresyon seviyesini azaltarak nasıl hiperuyarılabilir hale geldiğini göstermektedir. Şekil 5 , bireysel örneklerin gen ekspresyonunu ortalamalar halinde birleştirir, böylece gen kümelerinin ekspresyonu ve bu gen transkriptinin proteininin yeri zaman serisi boyunca görselleştirilebilir.
Şekil 1: Deneysel tasarım ve tek hücreli seleksiyon. (A) Sıçan üçlüleri beş tedavi koşulundan birine rastgele atandı. (B) Tek hücreli transkriptom veri üretimi. (C) Analiz edilen genlerin karikatür gösterimi ve işlevleri. Yeşil renkteki genler test edilmedi. Resmi gen sembolü kullanılır. (D) Hücre tipi belirteçlerin gen ekspresyonu. Hata çubukları standart hatayı gösterir. Mikroglia ile karşılaştırıldığında nöronlar, p-değerleri = 0.0273, sırasıyla 3.94 x 10-10, 7.73 x 10-12. Th + nöronları, Th- nöronlarına (p = 4.56 x 10-11) ve mikrogliaya (p = 2.95678 x 10-15) kıyasla yüksek Th ekspresyonu gösterdi. Th- nöronları, GLP-1 + nöronları olduklarını gösteren Th + nöronlarına (p = 0.0106) ve mikroglia'ya (p = 0.0435) kıyasla GCG'nin yüksek ekspresyonunu gösterdi. *p < 0,05, ***p < 4 x 10-10. (E) Tüm örneklerin doğrusal ayrım analizi, iki boyutlu bir alanda toplanan üç hücre tipi arasında ölçülen tüm genler arasındaki farkı gösterir. NE nöronları ve GLP-1 nöronları arasındaki merkezcil mesafe = 3.30, NE nöronları ve mikroglia = 1.57, GLP-1 Nöronları ve mikroglia = 2.92. Bu rakam O'Sullivan ve ark. 202116'dan değiştirilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Bir toplu iş içindeki ham Ct değerlerinin grafiklerini teknik olarak çoğaltın. Her grafik, teknik deneysel bütünlüğü gösteren, birbirine karşı çizilmiş çip içi teknik kopyalar için ham Ct değerlerini görüntüler. Bu rakam O'Sullivan ve ark. 202116'dan değiştirilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Ham Ct değerlerinin grafiklerini partiler arasında teknik olarak çoğaltın. Her grafik, birbirine karşı çizilen çipler arası teknik kopyalar için ham Ct değerlerini görüntüler ve tüm partilerin birbiriyle karşılaştırılabilir olduğunu gösterir. Bu rakam O'Sullivan ve ark. 202116'dan değiştirilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: GLP-1 ile zenginleştirilmiş nöronal örneklerin ısı haritası. Isı haritası, GLP-1 ile zenginleştirilmiş nöron örneklerinin hücresel alt fenotiplerini bir alkol yoksunluk zaman serisi aracılığıyla görüntüler. Satırlar, büyük harflerle etiketlenmiş hücresel alt fenotip kümelerine sahip 10 hücreli havuzlanmış örnekleri temsil eder. Sütunlar, o örneklemdeki o gen için -1 ila +1 renk skalasında -ΔΔCt gen ekspresyon değerlerinin z-skorunu temsil eder. Gen kümeleri numara ile etiketlenir. Bu rakam O'Sullivan ve ark. 202116'dan değiştirilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: GLP-1 ile zenginleştirilmiş nöronal örneklerde sufenotip gen ekspresyonu. Hücresel diyagramlar, Şekil 4'teki ısı haritasında gösterilen subfenotiplerin göreceli gen ekspresyonunu (-ΔΔCt değerlerinin ortalama z-skoru) temsil eden kutuları görüntüler. Diyagramlar Cytoscape versiyon 3.8.0 kullanılarak oluşturulmuş ve z-skorları R versiyon 3.5.2'deki ölçek fonksiyonu kullanılarak hesaplanmıştır. -Sağdaki ΔΔCt etiketleri hangi kutuların hangi gene karşılık geldiğini ve rengin ifadeyi temsil ettiğini gösterir (mavi düşük ifadedir ve sarı yüksek ifadedir). Kutunun yeri, protein ürününün bu gen transkriptinden lokalizasyonunu veya işlevini temsil eder. Yeşil sayılar subfenotipler içindeki alt grupları gösterir. Bu rakam O'Sullivan ve ark. 202116'dan değiştirilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: İnteroseptif vagal devre, viseral-duygusal nöroaksis ve bağımlılık karşıtı-süreç modelinin şeması. (A) İnteroseptif vagal afferentler, bağırsak mikroflorasından ve diğer periferik organlardan oldukça etkilenen bağırsak durumunu nucleus tractus solitarius'a (NTS) iletir. Bu bilgi daha sonra amigdala'ya aktarılır ve duygusal durumları etkiler. (B) Nucleus tractus solitarius'un (NTS) ve amigdala'nın (CeA) merkezi çekirdeğinin duygu, stres ve otonomik düzenlemedeki bütünleştirici rollerini gösteren basitleştirilmiş bir karikatür gösterimi. İki nöronal alt tip, GLP-1 ve NE nöronları vurgulanır. Birçok anatomik ve fonksiyonel bağlantı netlik için atlanmıştır. Kısaltmalar: NE = norepinefrin; GLP-1 = glukagon benzeri peptid 1; GABA = γ-aminobütirik asit; HPA ekseni = hipotalamik-hipofiz-adrenal eksen; CRF = kortikotropin salgılayan hormon. (C) Alkol ve / veya opioid maruziyetinin iki etkisi vardır: mezolimbik dopamin yolu yoluyla ödülü uyarmak ve antiödülü inhibe etmek. Bu eylemler, pozitif takviye yoluyla madde kullanımını motive eder. (D) Alkol ve / veya opioid yoksunluğunun iki etkisi vardır: mezolimbik dopamin yolunu inhibe ederek (gösterilmemiş) ödülü inhibe etmek ve antiödülü uyarmak. Bu çalışma, viseral-duygusal nöroinflamasyonun antireward stimülasyonunda bir son nokta olduğunu öne sürmektedir, ancak bu hipotez daha fazla test yapılmasını gerektirmektedir. Bu eylemler, mekanizma ne olursa olsun, olumsuz pekiştirme yoluyla madde bağımlılığını motive eder. Bu rakam O'Sullivan ve ark. 202116'dan değiştirilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Tablo 1: Mikroakışkan RT-qPCR için astarlar. mRNA amplifikasyonu için tüm primer çiftleri, her bir primer çifti tarafından oluşturulan amplikon uzunluğu ile birlikte listelenir. Bu tablo O'Sullivan ve ark. 202116'dan değiştirilmiştir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Alkol kullanım bozukluğu tedavisi zor bir hastalık olmaya devam etmektedir. Grubumuz bu bozukluğa, antireward süreçlerini sistem sinirbilimi perspektifiyle araştırarak yaklaşmıştır. Tek NTS nöronlarındaki ve mikrogliadaki gen ekspresyon değişikliklerini bir alkol yoksunluk zaman serisi16'da ölçtük. NTS, alkol yoksunluk sendromunda ortaya çıkan otonomik disregülasyondaki belirgin rolü nedeniyle seçildi. LCM'yi tek hücreli mikroakışkan RT-qPCR ile birleştirerek, anatomik ve moleküler duyarlılık ve özgüllük ile düşük maliyetle çok sayıda numune ve genin ölçülmesini sağlıyoruz (Şekil 1B-C). Tek hücreler IHC boyama ile tanımlandı ve seçildi ve bu hücresel subfenotip gruplamaları moleküler ekspresyon ile doğrulandı (Şekil 1D-E). Bununla birlikte, bazı GLP-1 zenginleştirilmiş nöronal örnekler (TH- nöronları) orta derecede Th'yi ifade etmiştir (Şekil 4). Hücre fenotipinin oluşturulması, floresan görselleştirmeye dayalı hücre seçiminde yapıldı ve bu kriter, tek bir genin ekspresyonuna dayanan moleküler gruplama olarak çalışma için kullanıldı, Th, hücresel bir fenotip16'yı düşündüren ekspresyon kalıplarını tanımlayamadı. Bu nedenle, sonuçlar majör NTS mikroglial ve nöronal subfenotipleri ve alkol yoksunluğundaki dinamiklerini karakterize eder.
Bu yazıda tek hücreli transkriptomikler için bir yöntem tanımlanmaktadır ve protokoldeki tüm adımların açıklandığı gibi izlenmesi zorunludur. Farklı organ dokuları veya hücre tipleri ile çalışırken bazı değişiklikler gerekebilir. Bu protokolün zorluklarından biri, LCM sırasında RNA kalitesini ve bütünlüğünü korumaktır. Yukarıda ayrıntılı olarak açıklandığı gibi zorlukları ele almak için IHC boyama, LCM ve mikroakışkan RT-qPCR protokolleri oluşturduk. Kısaca, bu prosesler RNA bozunmasını önlemek için tüm boyama çözeltilerine RNaz inhibitörünün eklenmesini, olası RNA bozulmasını önlemek için hızlı boyama protokolünü, IHC boyama ve dehidrasyondan hemen sonra LCM için slaytların işlenmesini ve numune işleme veya transferi sırasında mümkün olduğunda uygun soğuk koşulların korunmasını içerir.
Transkriptomik tahlil, RNA izolasyonu olmayan lize edilmiş tek hücreler üzerinde gerçekleştirilir, bunu ters transkripsiyon, ön amplifikasyon ve qPCR izler. Ön amplifikasyon adımı, cDNA moleküllerini seçici olarak qPCR için tespit edilebilir seviyelere yükseltmektir. Ön amplifikasyon adımında birkaç sınırlama vardır. Bunlar, mikroakışkan RT-qPCR'de tespit edilmemesine neden olacak şekilde güçlendirilemeyen gen transkriptlerini içerir. PCR reaksiyonu deneysel analiz için tüm primerleri içerdiğinden primer dimer oluşumu olasılığı da vardır. Yani, tek bir astar çiftinin ileri ve geri dizisi ve deneydeki tüm ileri ve geri dizileri ile dimerlerin oluşumu mümkündür. Bu nedenle, RNA standartları gibi pozitif deneysel kontrol kullanılarak yapılan primer testi tavsiye edilir.
RT-qPCR çip tasarımı, kalite kontrol ve parti efektleri için bu protokolün bir başka önemli yönüdür. Pozitif kontroller, test edilen hayvan ve organdan standart RNA'dan oluşur (bu temsili örnekte sıçan beyni). Bir RNA seyreltme serisi daha sonra her çipe yüklenebilir ve test edilen her gen için uygun nicel sinyali göstermelidir. Su negatif kontrol olarak kullanılabilir. Bu denetimler, farklı yongalardan gelen verileri birleştirirken oluşabilecek toplu iş etkilerini denetleyen uygun normalleştirme için kritik öneme sahiptir. Bu, adım 8'de ayrıntılı olarak tartışılmaktadır.
Burada gösterilen temsili deneyde, bu yöntemler hipotez üretmek ve olası mekanizma hakkında fikir vermek için uygulanmıştır. Çalışma başka bir çalışma bağlamında gerçekleştirilmiştir ve önleyici antireward hipotezi13 için önemli bilgiler sağlamaktadır. Kısacası, bu model, antiödülün NTS yoluyla vagustan amigdala'ya interoseptif sinyal vererek madde yoksunluğunda uyarıldığını ve bu antiödülün ilk substratının nöroinflamasyon olduğunu varsaymaktadır (Şekil 6). Bu çalışma, alkol çekilmesi üzerine nöronlarda ve mikrogliada gen ekspresyonundaki enflamatuar değişiklikleri belirleyerek bu hipotezi desteklemektedir.
Bu çalışmanın en büyük zayıflığı, mekanik iddiaların olmamasıdır. Bununla birlikte, bu yöntemler, bunun gibi bir temel deney gerçekleştirildikten sonra bir mekanizmayı belirlemek için kullanılabilir. Örneğin, subdiyafragmatik vagotomi veya gen nakavtı gibi bir hayvan modeli müdahalesi veya karışıklıklar, enflamatuar düzenleyicilerin anatomik veya genetik mekanizmalarını gösterebilir. Bu yaklaşımı benimseyen gelecekteki çalışmalar, bu içgörüleri bağımlılık tedavisi için klinik uygulamaya uygulamayı amaçlayan interoseptif antireward hipotezinin geliştirilmesine katkıda bulunabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar, rekabet eden finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Burada sunulan çalışma, JS ve RV'ye verilen NIH HLB U01 HL133360, JS ve EVB'ye verilen NIDA R21 DA036372, SJO'S'u desteklemek için Jan Hoek'e verilen T32 AA-007463 ve Ulusal Alkolizm ve Alkol İstismarı Enstitüsü: R01 AA018873 aracılığıyla finanse edildi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 20X DNA Binding Dye | Fluidigm | 100-7609 | NA |
| 2x GE Assay Loading Reagent | Fluidigm | 85000802-R | NA |
| 96.96 Dynamic Array IFC for Gene Expression (referred to as qPCR chip in text) | Fluidigm | BMK-M-96.96 | NA |
| Anti-Cd11β Antibody | Genway Biotech | CCEC48 | Microglia Stain |
| Anti-NeuN Antibody, clone A60 | EMD Millipore | MAB377 | Neuronal Stain |
| Anti-tyrosine hydroxylase antibody | abcam | ab112 | Stain for TH+ neurons |
| ArcturusXT Laser Capture Microdissection System | Arcturus | NA | NA |
| Biomark HD | Fluidigm | NA | RT-qPCR platform |
| Bovine Serum Antigen | Sigma-Aldrich | B4287 | |
| CapSure Macro LCM Caps | ThermoFisher Scientific | LCM0211 | NA |
| CellDirect One-Step qRT-PCR Kit | ThermoFisher Scientific | 11753500 | Lysis buffer solution components |
| CellsDirect Resuspension & Lysis Buffer Kit | ThermoFisher Scientific | 11739010 | Invitrogen |
| DAPI | ThermoFisher Scientific | 62248 | Nucleus Stain |
| DNA Suspension Buffer | TEKnova | T0221 | |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) ReadyProbe Secondary Antibody, Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) ReadyProbe Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | R37118 | Seconadry Antibody |
| Exonuclease I | New Englnad BioLabs, Inc. | M0293S | NA |
| ExtracSure Sample Extraction Device | ThermoFisher Scientific | LCM0208 | NA |
| FisherbrandTM Superfrost Plus Microscope Slides | ThermoFisher Scientific | 22-037-246 | Plain glass slides |
| GeneAmp Thin-Walled Reaction Tube | ThermoFisher Scientific | N8010611 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L), Superclona Recombinant Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 | ThermoFisher Scientific | A28180 | Seconadry Antibody |
| IFC Controller | Fluidigm | NA | NA |
| RNaseOut | ThermoFisher Scientific | 10777019 | |
| SsoFast EvaGreen Supermix with Low Rox | Bio-Rad | PN 172-5211 | NA |
| SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit | ThermoFisher Scientific | 11754250 | Contains VILO and SuperScript |
| T4 Gene 32 Protein | New Englnad BioLabs, Inc. | M0300S | NA |
| TaqMan PreAmp Master Mix | ThermoFisher Scientific | 4391128 | NA |
| TE Buffer | TEKnova | T0225 | NA |
| TempPlate Semi-Skirted 96-Well PCR Plate, 0.2 mL | USA Scientific | 1402-9700 | NA |
References
- Substance Use and Mental Health Indicators in the United States: Results from the 2019 National Survey on Drug Use and Health. , Available from: https://www.samhsa.gov/data/ (2020).
- Prevalence of Serious Mental Illness (SMI). NIH. 49, Available from: https://www.nimh.nih.gov/health/statistics/mental-illness.shtml (2020).
- Mattick, R. P., Kimber, J., Breen, C., Davoli, M. Buprenorphine maintenance versus placebo or methadone maintenance for opioid dependence. Cochrane Database of Systematic Reviews. Mattick, R. P. , John Wiley & Sons, Ltd. (2008).
- Mattick, R. P., Breen, C., Kimber, J., Davoli, M. Methadone maintenance therapy versus no opioid replacement therapy for opioid dependence. The Cochrane Database of Systematic Reviews. 2009 (3), (2009).
- Miller, P. M., Book, S. W., Stewart, S. H. Medical treatment of alcohol dependence: A systematic review. International Journal of Psychiatry in Medicine. 42 (3), 227-266 (2012).
- Holmes, E. A., et al. The Lancet Psychiatry Commission on psychological treatments research in tomorrow's science. The Lancet. Psychiatry. 5 (3), 237-286 (2018).
- Ford, C. L., Young, L. J. Translational opportunities for circuit-based social neuroscience: advancing 21st century psychiatry. Current Opinion in Neurobiology. 68, 1-8 (2021).
- Holmes, E. A., Craske, M. G., Graybiel, A. M. Psychological treatments: A call for mental-health science. Nature. 511 (7509), 287-289 (2014).
- Miranda, A., Taca, A. Neuromodulation with percutaneous electrical nerve field stimulation is associated with reduction in signs and symptoms of opioid withdrawal: a multisite, retrospective assessment. The American Journal of Drug and Alcohol Abuse. 44 (1), 56-63 (2018).
- Metz, V. E., et al. Effects of ibudilast on the subjective, reinforcing, and analgesic effects of oxycodone in recently detoxified adults with opioid dependence. Neuropsychopharmacology. 42 (9), 1825-1832 (2017).
- Heinzerling, K. G., et al. placebo-controlled trial of targeting neuroinflammation with ibudilast to treat methamphetamine use disorder. Journal of Neuroimmune Pharmacology. 15 (2), 238-248 (2020).
- Bogenschutz, M. P., et al. Psilocybin-assisted treatment for alcohol dependence: A proof-of-concept study. Journal of Psychopharmacology. 29 (3), 289-299 (2015).
- O'Sullivan, S. J., Schwaber, J. S. Similarities in alcohol and opioid withdrawal syndromes suggest common negative reinforcement mechanisms involving the interoceptive antireward pathway. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 125, 355-364 (2021).
- O'Sullivan, S. J. Single-cell systems neuroscience: A growing frontier in mental illness. Biocell. 46 (1), 7-11 (2022).
- O'Sullivan, S. J., et al. Single-cell glia and neuron gene expression in the central amygdala in opioid withdrawal suggests inflammation with correlated gut dysbiosis. Frontiers in Neuroscience. 13, 665 (2019).
- O'Sullivan, S. J., McIntosh-Clarke, D., Park, J., Vadigepalli, R., Schwaber, J. S. Single cell scale neuronal and glial gene expression and putative cell phenotypes and networks in the nucleus tractus solitarius in an alcohol withdrawal time series. Frontiers in Systems Neuroscience. 15, 739790 (2021).
- O'Sullivan, S. J., Reyes, B. A. S., Vadigepalli, R., Van Bockstaele, E. J., Schwaber, J. S. Combining laser capture microdissection and microfluidic qpcr to analyze transcriptional profiles of single cells: A systems biology approach to opioid dependence. Journal of Visualized Experiments. (157), e60612 (2020).
- Achanta, S., Vadigepalli, R. Single cell high-throughput qRT-PCR protocol. Protocols.io. , (2020).
- O'Sullivan, S. J. The interoceptive antireward pathway and gut dysbiosis in addiction. Journal of Psychiatry, Depression & Anxiety. 7 (40), 1-5 (2021).
- Park, J., et al. Single-cell transcriptional analysis reveals novel neuronal phenotypes and interaction networks involved in the central circadian clock. Frontiers in Neuroscience. 10, 481 (2016).
- Staehle, M. M., et al. Diurnal patterns of gene expression in the dorsal vagal complex and the central nucleus of the amygdala - Non-rhythm-generating brain regions. Frontiers in Neuroscience. 14, 375 (2020).
- Réus, G. Z., et al. The role of inflammation and microglial activation in the pathophysiology of psychiatric disorders. Neuroscience. 300, 141-154 (2015).
- Zhang, X., et al. Role of astrocytes in major neuropsychiatric disorders. Neurochemical Research. 46 (10), 2715-2730 (2021).
- Park, J., Ogunnaike, B., Schwaber, J., Vadigepalli, R. Identifying functional gene regulatory network phenotypes underlying single cell transcriptional variability. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 117 (1), 87-98 (2015).
- Lieber, C. S., DeCarli, L. M. An experimental model of alcohol feeding and liver injury in the baboon. Journal of Medical Primatology. 3 (3), 153-163 (1974).
- Lieber, C. S., Decarli, L. M. Animal models of chronic ethanol toxicity. Methods in Enzymology. 233, 585-594 (1994).
- Park, J., et al. Inputs drive cell phenotype variability. Genome Research. 24 (6), 930-941 (2014).
- Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates: Hard Cover Edition. , Academic Press. Elsevier Inc. (1982).
