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Neuroscience

Investigando Drivers de Anti-recompensa no Comportamento de Dependência com Métodos de Expressão Gênica de Célula Única Anatomicamente Específicos

Published: August 4, 2022 doi: 10.3791/64014
Automatic Translation
*1,2,3, *1, 1, 1
1Daniel Baugh Institute for Functional Genomics and Computational Biology, Department of Pathology, Anatomy, and Cell Biology, Thomas Jefferson University, 2Sidney Kimmel Medical College, Thomas Jefferson University, 3Department of Psychiatry and Behavioral Sciences, Stanford University School of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

A combinação de microdissecção de captura a laser e RT-qPCR microfluídica fornece especificidade anatômica e biotécnica na medição do transcriptoma em neurônios únicos e glia. A aplicação de métodos criativos com a abordagem biológica de um sistema para doenças psiquiátricas pode levar a avanços na compreensão e tratamento, como a hipótese anti-recompensa da neuroinflamação no vício.

Abstract

O aumento das taxas de comportamento de dependência motivou pesquisadores e clínicos de saúde mental a entender a anti-recompensa e a recuperação. Essa mudança da recompensa e do início requer novas perspectivas, paradigmas e hipóteses, juntamente com uma expansão dos métodos aplicados para investigar o vício. Aqui, fornecemos um exemplo: Uma abordagem de biologia de sistemas para investigar a anti-recompensa que combina microdissecção de captura a laser (LCM) e reações quantitativas quantitativas de cadeia da polimerase por transcrição reversa microfluídica de alto rendimento (RT-qPCR). A dinâmica da rede de expressão gênica foi medida e um dos principais impulsionadores da desregulação neurovisceral na abstinência de álcool e opioides, a neuroinflamação, foi identificado. Essa combinação de tecnologias fornece especificidade anatômica e fenotípica em resolução de célula única com sensibilidade de alto rendimento e medidas específicas de expressão gênica, produzindo conjuntos de dados geradores de hipóteses e possibilidades mecanicistas que geram oportunidades para novos insights e tratamentos.

Introduction

O vício continua sendo um desafio crescente no mundo desenvolvido 1,2. Apesar dos grandes avanços científicos e clínicos, as taxas de dependência continuam a aumentar, enquanto a eficácia dos tratamentos estabelecidos permanece estável na melhor das hipóteses 3,4,5. No entanto, os avanços na biotecnologia e nas abordagens científicas têm levado a novos métodos e hipóteses para investigar melhor a fisiopatologia da dependência de substâncias 6,7,8. De fato, desenvolvimentos recentes sugerem que novos conceitos e paradigmas de tratamento podem levar a avanços com consequências sociais, econômicas e políticas 9,10,11,12.

Investigamos o anti-recompensa na abstinência da dependência de álcool e opioides13,14,15,16. Os métodos são centrais para esse paradigma17,18. A microdissecção por captura a laser (LCM) pode selecionar células individuais com alta especificidade anatômica. Essa funcionalidade é parte integrante da hipótese anti-recompensa da neuroinflamação, pois tanto a glia quanto os neurônios podem ser coletados e analisados a partir do mesmo subnúcleo neuronal no mesmo animal 13,14,15,16,19. Uma porção relevante do transcriptoma de células selecionadas pode então ser medida com reações quantitativas de cadeia da polimerase por transcrição reversa microfluídica de alto rendimento (RT-qPCR), fornecendo conjuntos de dados de alta dimensão para análise computacional, fornecendo insights sobre redes funcionais20,21.

Medir um subconjunto do transcriptoma em neurônios e glia em um núcleo cerebral específico gera um conjunto de dados que é robusto tanto no número de amostras quanto nos genes medidos e é sensível e específico. Essas ferramentas são ótimas para a abordagem da neurociência de um sistema para doenças psiquiátricas, pois a glia, principalmente astrócitos e micróglias, demonstraram um papel central na doença neurológica e psiquiátrica na última década22,23. Nossa abordagem pode medir a resposta expressiva da glia e dos neurônios concomitantemente em vários receptores e ligantes envolvidos na sinalização parácrina local. De fato, a sinalização pode ser inferida a partir desses conjuntos de dados usando vários métodos quantitativos, como a lógica fuzzy24. Além disso, a identificação de subfenótipos celulares em neurônios ou glia e sua função pode fornecer informações sobre como as células cerebrais em núcleos específicos organizam, respondem e desregulam no nível de célula única. A dinâmica desse sistema funcional também pode ser modelada com experimentos de sériestemporais 16. Por fim, os modelos animais podem ser perturbados anatomicamente ou farmacologicamente para emprestar uma condição mecanicista à abordagem desse sistema.

Experiência representativa:
Abaixo, fornecemos um exemplo da aplicação desses métodos. Este estudo investigou a expressão gênica neuronal e microglia de ratos no núcleo solitário (SNT) em resposta à dependência de álcool e subsequente abstinência16. As coortes de ratos compreenderam 1) Controle, 2) Etanol-dependente (EtOH), 3) Retirada de 8 h (Wd), 4) Wd de 32 h e 5) Wd de 176 h (Figura 1A). Após a rápida decapitação, os caules cerebrais foram separados do prosencéfalo e criosseccionados, e fatias foram coradas para neurônios e micróglia positivos para tirosina hidroxilase (TH +) (Figura 1B). O LCM foi usado para coletar neurônios TH+ e TH- e microglia. Todas as células eram do NTS e analisadas como amostras de pools de 10 células. Quatro matrizes dinâmicas microfluídicas RT-qPCR de 96 x 96 foram executadas na plataforma RT-qPCR medindo 65 genes (Figura 1B-C). Os dados foram normalizados pelo método -ΔΔCt e analisados por R, e a seleção unicelular foi validada com marcadores moleculares (Figura 1D-E). A validação técnica foi ainda verificada por meio de repetições técnicas analisadas dentro de um único lote e entre lotes (Figura 2 e Figura 3). Neurônios TH+ e TH- organizados em diferentes subfenótipos com clusters de genes inflamatórios semelhantes, mas diferentes clusters de receptores (R) de ácido γ-aminobutírico (GABA) (Figura 4 e Figura 5). Os subfenótipos que apresentaram expressão elevada de clusters de genes inflamatórios foram super-representados em 32 h Wd, enquanto a expressão do receptor GABA (GABAR) permaneceu baixa na abstinência prolongada de álcool (176 h Wd). Este trabalho contribui para a hipótese antirecompensa da dependência de álcool e opioides, que conjectura que o feedback interceptivo das vísceras na abstinência contribui para a desregulação dos núcleos neuronais visceral-emocionais (ou seja, NTS e amígdala), resultando em sequelas autonômicas e emocionais mais graves, que contribuem para a dependência de substâncias (Figura 6).

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Protocol

Este estudo foi realizado de acordo com as recomendações do Comitê de Cuidado e Uso de Animais (IACUC) da Thomas Jefferson University. O protocolo foi aprovado pela IACUC da Universidade Thomas Jefferson.

1. Modelo animal

  1. Trigêmeos machos domésticos Sprague Dawley (>120 g, Harlan, Indianápolis, IN, EUA) individualmente com livre acesso à mistura de etanol-ração (2 ratos) ou ração controle (1 rato).
    NOTA: Este experimento representativo empregou o protocolo de Lieber-DeCarli para estudar a neurobiologia da abstinência alcoólica25,26. Trigêmeos de ratos consistem em uma coorte de três ratos a serem alimentados com o mesmo número de calorias, mas acabam em braços diferentes do estudo no sacrifício. Os três braços para este estudo são: 1) Controle, 2) Etanol-dependente (EtOH) e 3) Retirada (Wd) (Figura 1A). Há cinco condições totais neste estudo, pois há três pontos de tempo de abstinência alcoólica (Figura 1A).
    1. A cada dois dias, meça a mistura etanol-ração consumida pelo rato Wd e substitua a quantidade consumida pela mesma quantidade de mistura de etanol para o alimentador de ratos EtOH. Adicionar a quantidade calórica equivalente de mistura de controlo ao alimentador do rato de controlo.
      NOTA: O consumo médio diário de etanol é de cerca de 12-16 g / kg após 3 semanas26.
    2. Após o consumo e dependência estáveis de etanol a longo prazo (>5 semanas), induza a abstinência aguda de álcool em ratos Wd esvaziando seu recipiente de alimentos e enchendo-o com mistura de controle. Realize isso de tal forma que todos os três ratos sejam sacrificados no mesmo ponto de tempocircadiano 21.
    3. No ponto de tempo pré-escolhido, sacrifique todos os três ratos no trio no mesmo ponto de tempo (Control, EtOH e Wd).

2. Colheita da amostra

  1. Colher o cérebro no mesmo ponto de tempo circadiano para cada trio de rato no ponto de tempo Wd adequado (8 h, 32 h, 176 h).
    1. Prepare um banho de metanol e gelo seco para resfriamento rápido de tecido fresco para preservar a integridade do RNA. Coloque de lado.
    2. Coloque o rato em tanque de isoflurano (5% em oxigênio) por ~30 s ou até que ocorra perda de consciência, conforme indicado pela redução da frequência respiratória e ausência de atividade motora. Coloque a cabeça do rato em uma guilhotina devidamente afiada para decapitar rapidamente.
    3. Abra o crânio do animal para dissecar o cérebro usando fórceps. Remova o cerebelo do cérebro fresco com uma navalha de mão por corte grosseiro e descarte-o. Por incisão transversal, corte o tronco cerebral do prosencéfalo.
      NOTA: Uma navalha portátil pode ser usada ainda mais para hemi-sectar o prosencéfalo ou tronco encefálico nos hemisférios esquerdo e direito de acordo com o desenho experimental. Por exemplo, para validar achados de um hemisfério com métodos diferentes, investigar a divergência esquerda-direita ou aumentar o número da amostra.
    4. Adicione a temperatura de corte ideal (O.C.T.) média a aproximadamente 3-4 cm de profundidade no molde de incorporação de tecido para que a amostra de tecido possa ser totalmente imersa. Coloque o tecido, o prosencéfalo e/ou o tronco encefálico no molde de incorporação do tecido e adicione mais OCT para cobrir totalmente a amostra de tecido.
    5. Adicione o molde de incorporação de tecido plástico contendo a amostra de tecido (prosencéfalo de rato) no banho de resfriamento de gelo seco e metanol para congelar imediatamente a amostra de tecido. Deixe a amostra de tecido no molde de incorporação permanecer no banho de resfriamento até que a coleta de tecido esteja completa, mas não por mais de 15 minutos.
      NOTA: Tenha cuidado para evitar que o metanol se derrame no recipiente de tecido.
    6. Armazene rapidamente amostras de tecido a -80 °C.
      NOTA: O RT-QPCR microfluídico mede a expressão gênica amplificando e medindo os transcritos de mRNA. Esses transcritos são relativamente instáveis, então muitas etapas são tomadas neste processo para manter a amostra o mais fria possível para evitar a degradação do mRNA.

3. Criosecção

NOTA: Os núcleos neuronais de um rato são de aproximadamente 10 μm. Assim, 10 μm é a espessura de corte ideal para este modelo animal. A espessura da fatia é ajustada de acordo com o modelo animal para o estudo.

  1. Do congelador a -80 °C, retire o molde de incorporação de tecido que contém o tronco encefálico congelado e descongele a amostra a -20 °C no criostato durante 5-10 min. Efectuar este congelamento-descongelamento a -20 °C apenas uma vez para preservação do ARNm.
  2. Com uma navalha de mão, corte verticalmente os cantos do molde de incorporação de plástico. Remova o tronco encefálico embutido no O.C.T. do molde de incorporação de tecido plástico. No mandril do criostato fixado a -20 °C, use o líquido O.C.T. à temperatura ambiente como cola para montar o tronco encefálico na direção rostral a caudal para criosecção coronal.
  3. Corte 10 μm de criosecções coronais na direção rostral a caudal do tronco encefálico de ratos até que as seções contendo a região de interesse (NTS) sejam atingidas. A altura e a largura dessas crioseções são de ~ 200 mm com base nas dimensões do molde de incorporação de plástico.
  4. Colete as criosecções de 10 μm de tecido do tronco encefálico que incluem o NTS, ou outra região de interesse com base no estudo, descongelando a montagem em lâminas de vidro simples à temperatura ambiente. Rapidamente, coloque essas lâminas com seções em uma panela de metal de resfriamento que esteja situada em cima do gelo seco. Logo que possível, coloque lâminas de vidro contendo criosecções no congelador a -80 °C para armazenamento.
    NOTA: Uma única lâmina de vidro pode caber em várias criosecções de 10 μm, pois a largura e a altura são de ~200 mm. Assim, a mesma lâmina pode conter criosecções que são coradas para tipos de células distintas.
    1. Quando várias seções estiverem no slide, certifique-se de que elas estejam separadas por 100 mm de espaço vazio. Para criar uma borda entre as criossecções, use uma caneta hidrofóbica. Isso permite que diferentes soluções de anticorpos manchem diferentes tipos de células na mesma lâmina de vidro. Mantenha 20 mm de espaço para a criossecção a partir da borda da lâmina de vidro.

4. Coloração por imunofluorescência de células únicas

  1. Use o protocolo de imunofluorescência de coloração rápida em criosecções cerebrais para rotular os tipos desejados de células cerebrais (neurônios, micróglia, astrócitos, etc.) para coleta usando LCM.
    NOTA: O protocolo de coloração imuno-histoquímica usado para esses experimentos foi projetado para ser rápido para evitar o excesso de degradação de mRNA durante este processo.
    1. Do congelador a -80 °C, retire lâminas de vidro contendo criosecções de 10 μm de tronco encefálico de rato contendo NTS. Mergulhe as lâminas por 30 s em banho de etanol a 75% para fixar o tecido crioseccionado. Remova o excesso de líquido.
    2. Para o tecido fixo criosseccionado do tronco encefálico, aplique 2% de albumina sérica bovina (BSA) em solução salina tampão fosfato (PBS) por 30 s para bloquear a ligação não direcionada de anticorpos. Depois, lave com PBS.
    3. Aplique uma quantidade suficiente de solução de anticorpos primários para cobrir o tecido criosseccionado (agora fixo e bloqueado). Incubar a secção tecidual em solução de anticorpos primários durante 2 min. Lave o tecido com solução de BSA a 2% uma vez. A solução primária de anticorpos contém 96% da solução de BSA-PBS para bloqueio, 3% de anticorpos primários e 1% de inibidor de RNase. O anticorpo primário foi diluído na proporção de 1:25.
      NOTA: Neste experimento representativo, os anticorpos primários consistem em anticorpos anti-NeuN e anticorpos anti-Cd11β. Os neurônios foram subdivididos em subgrupos TH+ e TH-, de modo que as soluções primárias de anticorpos para coloração neuronal continham 93% da solução BSA PBS, 3% anticorpo anti-NeuN, 3% anticorpo anti-tirosina hidroxilase e 1% RNase Out.
    4. Aplique uma quantidade suficiente de solução de anticorpos secundários (1:200) para cobrir o tecido do tronco encefálico. Deixe a solução de anticorpos secundários banhar o tecido. Após 3 min, lave o tecido com solução de BSA a 2% uma vez.
      NOTA: A solução contendo o anticorpo secundário foi composta por 196,5 μL de BSA a 2%, 1 μL de tag fluorescente anti-rato de cabra 555 nm para o tipo de célula, 1 μL de burro anti-coelho Alexa 488 nm para coloração TH, inibidor de RNase de 2,5 μL e 1,3 μL de DAPI (1:10000).

5. Série padrão de desidratação do tecido de etanol e xileno

  1. Coloque lâminas de vidro sobre as quais o tecido criosseccionado manchado repousa em um banho de etanol a 75% por 30 s, seguido de colocar em banho de etanol a 95% por 30 s, um banho de etanol a 100% por 30 s e, finalmente, um etanol a 100% por 30 s (em um segundo recipiente).
  2. Depois de completar a série de desidratação de etanol, despeje dois banhos frescos de xileno 100%. Em seguida, coloque as lâminas de vidro no primeiro banho de xileno por 1 min. Retire rapidamente e coloque as lâminas no outro banho de xileno fresco por 4 minutos.
  3. Tire as lâminas de vidro contendo criosecções de tecido manchadas e desidratadas de xileno e coloque em um recipiente escuro, mas ventilado, por 5 minutos para secar ao ar. Após a secagem ao ar, coloque as lâminas de vidro em um exsicador por 5 minutos para a secagem final.

6. Selecione células individuais usando microdissecção de captura a laser (LCM)

  1. Insira a lâmina de vidro contendo criosecções de tecido manchado, fixo e desidratado no suporte da amostra do microscópio LCM. Use pontos de referência anatômicos para localizar a região de interesse a partir da qual a coleta de células ocorrerá (NTS neste exemplo representativo).
  2. Ligue a fluorescência do microscópio e encontre o(s) tipo(s) de células coradas(ões) de interesse. Certifique-se de que o núcleo da célula desejada esteja na região de interesse e seja isolado dos núcleos de outras células a uma distância >3 mm. Identifique e marque uma célula (se o experimento for verdadeiro de célula única) ou várias células (se o experimento exigir amostras agrupadas de célula única [ou seja, escala de célula única], conforme demonstrado neste experimento representativo) para coletar usando o software LCM.
    NOTA: Amostras compostas por pools de 10 células foram utilizadas neste experimento representativo. Isso é feito para diminuir a variabilidade da expressão gênica entre as amostras e aumentar o número de células únicas analisadas, embora isso ainda permaneça um experimento em escala de célula única. Verdadeiros experimentos unicelulares podem ser completados com este método20,27. Além disso, seções maiores de tecido também podem ser selecionadas21.
  3. Depois que as células desejadas forem selecionadas, use o braço robótico LCM, coloque a tampa LCM na região de interesse na criossecção de tecido marcada.
  4. Calibre a intensidade e a mira do laser infravermelho (IR) usando tiros de teste.
    NOTA: Isso é feito para cada amostra. A calibração deve ser realizada em uma seção da tampa que não esteja diretamente sobre o tecido, de modo a não selecionar erroneamente o tecido não experimental.
    1. Para calibrar a intensidade, ajuste a duração, a força e o tamanho do disparo a laser IR para que um tiro apenas derreta o adesivo da tampa o suficiente para selecionar um único núcleo celular e também seja forte o suficiente para derreter a tampa para a criossecção na lâmina. Esses valores serão diferentes para cada capitalização.
    2. Calibre a segmentação localizando a mira do laser precisamente onde o laser derreteu a tampa.
  5. Reúna as células identificadas disparando o laser infravermelho LCM para derreter a tampa no tecido criossecado sobre essas células. Certifique-se de que apenas as células selecionadas foram retiradas da fatia de tecido usando o braço do robô para localizar a tampa na área de controle de qualidade (QC) do microscópio LCM. Para remover qualquer excesso de células na tampa, use laser ultravioleta (UV) para obliterar o material genético das células extras.
  6. Registre a especificidade anatômica com a câmera do software LCM. Tire uma foto do tecido criosseccionado do qual a(s) célula(s) foi(foram) removida(s).
  7. Use um atlas anatômico (um atlas do prosencéfalo de rato neste exemplo) para determinar a distância dessa fatia de tecido do bregma e registrar essa informação como a distância Z28. Determine o local no plano X e/ou Y da foto para localizar totalmente a célula selecionada.
  8. Com as mãos enluvadas, remova a tampa LCM da área do QC. Em seguida, prenda o dispositivo de extração de amostra à tampa do LCM. Use uma pipeta para aplicar 5,5 μL de tampão de lise à(s) célula(s) selecionada(s). Isso agora é chamado de amostra.
    NOTA: A solução tampão de lise é composta por tampão de ressuspensão de 5 μL juntamente com 0,5 μL de potenciador de lise.
  9. Encaixe um tubo de microcentrífuga de 0,5 mL no dispositivo de extração de amostras que está conectado à tampa do LCM. Colocar este arranjo numa placa de aquecimento a 75 °C com a amostra e o tampão de lise mais próximos da placa. Deixe a amostra aquecer por 15 min.
  10. Use uma centrífuga de baixa velocidade a 0,01-0,02 x g para girar a amostra e o tampão de lise para o fundo do tubo de microcentrífuga de 0,5 mL. Conservar a amostra a -80 °C até à qPCR microfluídica.

7. Execute o chip qPCR em um RT-qPCR microfluídico na plataforma

  1. Para medir a expressão gênica de amostras unicelulares, realize a pré-amplificação de RNAm, conforme descrito abaixo.
    NOTA: O protocolo não envolve a extração de mRNA, pois as amostras são células únicas contendo uma quantidade muito baixa de RNA (10 pg), que será perdida durante a etapa de isolamento do mRNA. As células individuais são lisadas e diretamente processadas para transcrição reversa para minimizar a perda da amostra.
    1. Crie um pool de iniciadores adicionando os primers do gene qPCR de mRNA (para frente e para trás) para cada gene que está sendo ensaiado em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Certifique-se de que a concentração final de cada primer é de 500 nM. Os primers neste experimento de exemplo estão listados na Tabela Suplementar 116.
    2. Pipeta 1 μL de 5x cDNA reação misturar em cada poço de uma placa de PCR de 96 poços.
    3. Deixar as amostras de célula única descongelarem brevemente (2-3 min), retirando-as do congelador a -80 °C e deixando-as sentar-se à temperatura ambiente. Use uma centrífuga de baixa velocidade em 0,01-0,02 x g para girar as amostras para baixo por 20-30 s. Pipeta 5,5 μL de cada amostra de célula única para um poço diferente na placa de PCR de 96 poços.
      Observação : O número da amostra e o tipo a ser colocado em cada poço são determinados antes de iniciar esta etapa.
    4. A placa de PCR de 96 poços agora tem a mistura de reação cDNA e uma amostra de célula única adicionada a cada poço. Colocar esta placa num termociclador durante 1,5 min a 65 °C para activar a mistura de reacção de cDNA. Girar o conteúdo utilizando centrifugação de alta velocidade a 1.300 x g durante 1 min a 4 °C e colocar a placa de PCR no gelo húmido.
    5. Em cada poço na placa de PCR, pipeta 0,12 μL de proteína T4 Gene 32, 0,73 μL de tampão de suspensão de DNA e 0,15 μL de 10x cDNA síntese master mix. Executar a placa de PCR através do seguinte protocolo no termociclador: 25 °C por 5 min, 50 °C por 30 min, 55 °C por 25 min, 60 °C por 5 min, 70 °C por 10 min e uma retenção final a 4 °C.
      NOTA: A proteína T4 Gene 32 (uma proteína de ligação ao DNA de fita simples (ssDNA)) é necessária para a replicação e reparo do bacteriófago T4. A proteína T4 Gene 32 foi utilizada na etapa de transcrição reversa do protocolo para melhorar o rendimento e a eficiência da transcrição reversa e aumentar o rendimento do produto em PCR.
    6. Em cada poço na placa de PCR, pipeta 7,5 μL de Taq polimerase master mix. Em seguida, em cada poço, pipeta 1,5 μL do pool de primer criado na etapa 7.1.1. Executar a placa de PCR através da seguinte etapa de pré-amplificação linear no termociclador: 95 °C durante 10 min; 22 ciclos de: 96 °C para 5 s e 60 °C para 4 min.
    7. Em cada poço na placa de PCR, pipeta 1,2 μL de exonuclease I, 4,2 μL de tampão de suspensão de DNA e 0,6 μL de 10x tampão de reação exonuclease I. Executar a placa de PCR através do seguinte protocolo no termociclador: 37 °C durante 30 min, 80 °C durante 15 min.
      NOTA: A exonuclease catalisa a remoção de nucleotídeos do DNA linear de fita simples na direção de 3' a 5'. Usamos exonuclease para limpeza de amostras para a remoção de primers não incorporados e qualquer cDNA de fita simples que possa estar presente após a pré-amplificação.
    8. Em cada poço na placa de PCR, pipeta 54 μL de tampão TE. Use uma centrífuga de alta velocidade a 1.300 x g por 5 minutos a 4 °C para girar o conteúdo da placa de PCR.
    9. Se planeia continuar com a próxima fase do protocolo, refrigerar a placa de PCR a 4 °C. Se houver mais de 12 h entre a conclusão da fase de pré-amplificação e o início da qPCR microfluídica, cubra a placa de qPCR e coloque-a num congelador de -20 °C.
  2. Faça a placa de amostra (nova placa de PCR de 96 poços) para o chip qPCR, conforme descrito abaixo.
    1. Se a placa de PCR de pré-amplificação da etapa 7.1 foi colocada em um freezer de -20 °C, remova e deixe descongelar à temperatura ambiente por 10 min.
    2. Em uma nova placa de PCR de 96 poços, pipete para cada poço 4,55 μL de PCR supermix baixo rox e 0,45 μL de 20x corante de ligação ao DNA. Em seguida, pipetar 3 μL de amostra pré-amplificada da placa de PCR feita na etapa 7.1. Use centrifugação de alta velocidade a 1.300 x g por 5 min a 4 °C para girar a placa de PCR e colocar a placa de amostra de PCR no gelo.
  3. Faça uma placa de ensaio (uma nova placa de PCR de 96 poços) para o chip qPCR, conforme descrito abaixo.
    1. Em uma nova placa de PCR de 96 poços, pipete para cada poço 1,25 μL de tampão de suspensão de DNA e 3,75 μL de reagente de carregamento de ensaio 2x. Em seguida, pipete o primer qPCR correspondente a 2,5 μL do primer de 10 μM. Use centrífuga de alta velocidade a 1.300 x g por 5 min a 4 °C para girar a placa de PCR e colocar a placa de ensaio de PCR no gelo.
  4. Prepare o chip qPCR para carregamento na plataforma microfluídica RT-qPCR, conforme descrito abaixo.
    NOTA: O chip qPCR é uma plataforma qPCR em tempo real que trabalha com base em princípios microfluídicos. O chip qPCR é essencialmente uma matriz de 96 canais de amostra e 96 canais de iniciadores de qPCR de RNA (ou seja, ensaios) que se cruzam em 9.216 (96 x 96) câmaras. Uma amostra e um ensaio específico são combinados em cada câmara da matriz na qual ocorre uma reação qPCR em tempo real. A leitura é gerada como valores de ciclo limiar (Ct) e gráficos de amplificação para os primers utilizados.
    1. Injete fluido de linha de controle no chip qPCR para escorva. Insira o chip qPCR no dispositivo de mistura microfluídica. Selecione o script prime (136x) e execute este programa.
    2. Quando o programa estiver concluído após ~ 45 min, remova o chip qPCR preparado. No chip qPCR preparado, pipetar 6 μL da reação da placa de amostra de PCR para o poço de amostra correspondente no chip de qPCR.
    3. No chip qPCR preparado, pipeta 6 μL da reação da placa de ensaio de PCR para o poço de ensaio correspondente no chip de qPCR.
      NOTA: Bolhas de ar podem se formar na parte inferior da amostra e poços de ensaio no chip qPCR, o que pode impedir que as soluções entrem nos condutos microfluídicos. Uma agulha afiada pode ser usada para estourar ou remover essas bolhas de ar antes de inserir o chip qPCR no dispositivo de mistura microfluídica.
    4. Insira o chip qPCR no dispositivo de mistura microfluídica. Selecione o script de mistura de carga (136x) e execute este programa.
  5. Carregue o chip qPCR na plataforma microfluídica RT-qPCR.
    1. Ligue a plataforma microfluídica RT-qPCR e aqueça a lâmpada (~20 min). Remova o chip qPCR do dispositivo de mistura microfluídica. Descasque o adesivo protetor da parte inferior do chip qPCR.
    2. Abra a plataforma microfluídica RT-qPCR e carregue o chip qPCR na plataforma microfluídica RT-qPCR. Execute o protocolo rápido de PCR 96 x 96 (30 ciclos) na plataforma microfluídica RT-qPCR.
    3. Inicie o software de coleta de dados - clique em Iniciar uma nova execução.
    4. Verifique o código de barras do chip e o tipo de chip - clique em Avançar. Clique no arquivo Chip Run e navegue pelo local do arquivo para o armazenamento de coleta de dados.
    5. Clique em Tipo de Aplicação e selecione Expressão Gênica; selecione ROX para referência passiva, selecione Sonda única e selecione EvaGreen para o tipo de sonda.
    6. Clique para selecionar o programa de ciclo térmico e selecione Biomark HD: GE Fast 96x96 PCR+Melt v2.pcl file.

8. Análise dos dados

  1. Carregue os dados do chip qPCR executados para o software de análise para QC, conforme descrito abaixo.
    1. Baixe o software de análise de dados. Isso pode ser encontrado no seguinte site: https://www.fluidigm.com/products-services/software#. Inicie o software para analisar o experimento microfluídico RT-qPCR.
    2. Dentro do software, abra o Chip Run. Em seguida, abra o arquivo ChipRun.bml que foi criado pelo experimento. Uma janela aparecerá com os detalhes experimentais, incluindo a referência passiva, a sonda e o programa térmico de PCR.
      NOTA: O controle de qualidade (QC) e a análise de dados podem ser feitos no computador conectado à plataforma microfluídica RT-qPCR ou transferindo o arquivo .bml para um computador diferente por meio de uma unidade flash ou outros meios.
  2. Defina a configuração de exemplo conforme descrito abaixo.
    NOTA: Esta etapa cria um modelo rotulado de amostras e ensaios (iniciadores qPCR) para os procedimentos de controle de qualidade (QC) e análise de dados.
    1. Selecione Chip Explorer > Sample Plate Setup e crie uma nova placa de amostra. Selecione o tipo de recipiente apropriado e o formato de recipiente (SBS96 para uma placa de 96 poços usada neste experimento representativo).
    2. Cole os rótulos de amostra na planilha do software de acordo com o experimento e selecione Mapa no menu Tarefa. Selecione SBS96-Left.dsp. A configuração de exemplo agora está mapeada. Selecione Exibição de detalhes > Analisar para atualizar essas alterações no arquivo.
      NOTA: Quaisquer alterações feitas neste software não serão salvas até que o botão Analisar seja clicado.
  3. Defina as amostras de controle no software. Selecione as células para as amostras de controle clicando com o botão esquerdo do mouse e mantendo pressionado enquanto arrasta pelas células para seleção. As células individuais podem ser selecionadas pressionando e mantendo pressionada a tecla Ctrl e clicando em células individuais. Para as amostras padrão de ARN (séries de diluição), indicar o nome da amostra e a concentração de ARN utilizada. Clique em Analisar para salvar.
  4. Defina o detector configurado de forma semelhante à etapa 8.2 acima, mas com nomes de ensaio RT-qPCR, ou seja, os nomes dos genes ensaiados. Selecione Configuração da placa do detector e crie uma nova placa de ensaio. Selecione o tipo e o formato de recipiente apropriados (SBS96 para uma placa de 96 poços). Cole os nomes dos ensaios de acordo com o experimento e clique em Analisar para salvar.
  5. Inicie o processo de controle de qualidade (QC) do usuário conforme descrito abaixo.
    NOTA: Este experimento representativo usou um método de limiar de tempo de ciclo (Ct). Ou seja, as amostras que não atingiram um sinal de limite definido pelo software (Auto Global) ou manualmente (User Global) serão consideradas reações com falha e não incluídas no conjunto de dados.
    1. Selecione Modo de Exibição de Análise > Quadro de Tarefas. No painel de configurações de análise, altere as configurações para Global Automático (calcula automaticamente um limite aplicado a todo o chip) ou Global do Usuário. Defina a correção de linha de base como derivada linear. Se User Global for usado, o limite de falha deverá ser determinado manualmente, como no experimento representativo.
    2. Esse experimento representativo usou uma regra de QC da seguinte forma: se um ensaio ou amostra individual tivesse uma taxa de falha de 70% ou mais, então toda essa linha ou coluna no conjunto de dados seria reprovada.
    3. Revise manualmente cada reação no chip 96 x 96. Visualize as curvas de amplificação e as curvas de fusão para considerar se cada reação seguiu o padrão de qPCR esperado. Se a amplificação ou a curva de fusão não corresponder ao esperado, falhe essa reação.
  6. Após o QC, exporte os dados selecionando Arquivo > Exportar e salve o conjunto de dados como um arquivo .csv.
  7. Remova o conjunto de dados à medida que o arquivo .csv exportado tem uma matriz Pass-Fail e uma matriz com valores Ct brutos. Use a matriz Pass-Fail para substituir todas as células com falha no conjunto de dados por NA.
  8. Transfira a versão mais actualizada do software R de código aberto e, em seguida, transfira a aplicação R-Studio. Carregue o conjunto de dados normalizado em R. Analise os dados conforme adequado para o estudo.
  9. Normalize o conjunto de dados usando o método -ΔΔCt , conforme descrito abaixo.
    NOTA: A centralização mediana ou a normalização do gene de limpeza podem ser usadas em uma linha de amostra para gerar um valort -ΔC. No experimento representativo, a mediana de centralização foi utilizada e validada pela normalização do gene housekeeping. Isso pode ser feito em formato .csv ou fazendo o upload para um software de análise de dados.
    1. Para a centralização mediana, calcule o valor mediano de Ct calculado a partir de todos os valores de Ct para uma amostra individual (pool de 10 células). Em seguida, subtraia todos os valores individuais de Ct desse valor mediano. Isso produz um valort -ΔC.
    2. Para a normalização do gene de limpeza, calcule a expressão média dos genes de limpeza (Actb, Gapdh e Ldha no experimento representativo) para cada amostra e use esse valor como aquele do qual subtrair os valores individuais de Ct.
    3. Para gerar um valor t -ΔΔC, tome a mediana de cada coluna de ensaio, que agora contém o valort -ΔC. Subtraia a mediana do ensaio de cada valor t -ΔC para produzir um valort -ΔΔC.
  10. Calcule escores z para cada valort -ΔΔC usando a função de escala em R. Use a função de mapa de calor R ou um software separado para gerar um mapa de calor.
  11. Use a função de correlação de Pearson para calcular as correlações de Pearson entre cada gene. Use a função de fusão em R para organizar o conjunto de dados para outras funcionalidades. Exporte esses dados e carregue-os em um software de rede de correlação gênica.

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Representative Results

A validação da coleta de célula única é realizada visualmente durante os procedimentos de LCM. Os núcleos celulares são avaliados na estação QC. O tipo de célula pode ser determinado pela emissão de fluoróforo marcado para esse tipo de célula e sua morfologia geral. Se as células não desejadas tiverem sido selecionadas na tampa, seu material genético pode ser destruído com um laser UV na estação QC. É igualmente necessária uma validação adicional por análise molecular. Neste exemplo representativo16, foram selecionados dois tipos de neurônios - tirosina hidroxilase (Th) positiva (+) e Th negativa (-), além da micróglia. A Figura 1D demonstra que as amostras destinadas a serem neurônios demonstraram expressão elevada estatisticamente significativa do marcador neuronal, NeuN. Concomitantemente, as amostras microgliais apresentaram elevação significativa dos marcadores microgliais, CD34 e Cx3xr1, sugerindo que a seleção das amostras foi realizada com alta fidelidade. Além disso, amostras neuronais Th+ demonstraram expressão significativamente elevada de Th em comparação com amostras Th-neuronais e amostras de microglia, enquanto os neurônios-Th- demonstraram expressão significativamente elevada de GCG (um gene codificador de pré-proglucagon), sugerindo que essas amostras Th-neuronais são enriquecidas com neurônios que usam GLP-1 como neurotransmissor (Figura 1D ). Uma medida computacional mais global conhecida como análise discriminativa linear mostrou que esses três tipos de células tinham diferentes perfis de expressão gênica em todos os 65 genes medidos com neurônios e micróglias se separando ao longo do eixo x e amostras neuronais Th+ e Th-se dividindo ao longo do eixo y (Figura 1E).

A qualidade dos dados também foi validada com repetições técnicas intra e interlote (Figura 2 e Figura 3). O Intra-batch replica o controle da qualidade dos dados desse lote específico. Se as replicações intralote não se alinharem, outro experimento de chip qPCR pode ser realizado a partir da mesma amostra e placas de ensaio que foram feitas para executar o primeiro lote. As replicações entre lotes garantem que os dados de todos os lotes possam ser comparados. Isso é crucial para experimentos em que um grande número de amostras é ensaiado exigindo vários lotes, como este exemplo representativo. Houve um outlier neste experimento como amostra 40 no lote 4 (Figura 3). No entanto, a amostra 40 nos lotes 1, 2 e 3 corretamente alinhada, e as demais replicações do lote 4 alinhadas com os lotes 1, 2 e 3, sugerindo que esta foi uma reação ruim isolada, que ocorreu nesta replicação. A comparação entre lotes também requer técnicas adequadas de normalização de dados. Este experimento usou a centralização mediana, embora os genes de limpeza (Actb, Gapdh, Ldha), também tenham sido testados neste experimento e serviram como um controle para o método de centralização mediana. Ou seja, ambos os métodos produziram conjuntos de dados altamente análogos, sugerindo ainda mais alta qualidade de dados.

A Figura 4 exibe um mapa de calor de amostras neuronais enriquecidas com GLP-1 que é organizado por subfenótipo celular. Esta figura não só demonstra a importância dos subfenótipos celulares na neurobiologia, mas também demonstra como as proporções de subfenótipos mudam através da abstinência de álcool. O mapa de calor mostra que o subfenótipo A, que expressa altamente o cluster de genes inflamatórios 1, aumenta em razão no ponto de tempo de 8 h Wd e atinge um máximo em 32 h Wd. Por 176 h Wd, este subfenótipo inflamatório está normalizando sua prevalência de volta ao controle. O subfenótipo B, que expressa altamente o cluster 2 do gene GABAR , demonstra uma supressão global na expressão deste cluster genético pela condição de Wd de 176 h. Esses achados demonstram como esse tipo de célula neuronal GLP-1 se torna hiperexcitável aumentando seu subfenoype inflamatório e, simultaneamente, diminuindo o nível de expressão de GABARs em seu subfenótipo GABA durante a abstinência de álcool. A Figura 5 combina a expressão gênica de amostras individuais em médias para que a expressão de agrupamentos de genes e a localização da proteína desse transcrito gênico possam ser visualizadas ao longo da série temporal.

Figure 1
Figura 1: Delineamento experimental e seleção unicelular. (A) Trigêmeos de ratos foram aleatoriamente designados para uma das cinco condições de tratamento. (B) Geração de dados de transcriptoma unicelular. (C) Representação em cartum de genes ensaiados e sua função. Os genes em verde não foram ensaiados. O símbolo oficial do gene é usado. (D) Expressão gênica de marcadores de tipo celular. As barras de erro mostram o erro padrão. Neurônios comparados à micróglia, p-valores = 0,0273, 3,94 x 10-10, 7,73 x 10-12, respectivamente. Os neurônios Th+ apresentaram expressão Th elevada em comparação com os neurônios Th- (p = 4,56 x 10-11) e microglia (p = 2,95678 x 10-15). Os neurônios Th- apresentaram expressão elevada de GCG em comparação com os neurônios Th+ (p = 0,0106) e microglia (p = 0,0435), indicando que são neurônios GLP-1+. *p < 0,05, ***p < 4 x 10-10. (E) A análise discriminativa linear de todas as amostras mostra a diferença entre todos os genes medidos entre os três tipos de células coletadas em um espaço bidimensional. Distância do centroide entre os neurônios NE e os neurônios GLP-1 = 3,30, neurônios NE e micróglia = 1,57, Neurônios GLP-1 e micróglia = 2,92. Este número foi modificado de O'Sullivan et al. 202116. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Gráficos de replicação técnica de valores brutos de Ct dentro de um lote. Cada gráfico exibe valores brutos de Ct para replicações técnicas intrachip plotadas entre si, demonstrando integridade técnica experimental. Este número foi modificado de O'Sullivan et al. 202116. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Gráficos de replicação técnica de valores brutos de Ct entre lotes. Cada gráfico exibe valores brutos de Ct para replicações técnicas interchip plotadas entre si, demonstrando que todos os lotes são comparáveis entre si. Este número foi modificado de O'Sullivan et al. 202116. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Mapa de calor de amostras neuronais enriquecidas com GLP-1. O mapa de calor exibe subfenótipos celulares de amostras de neurônios enriquecidos com GLP-1 através de uma série temporal de abstinência de álcool. As linhas representam amostras agrupadas de 10 células com aglomerados de subfenótipos celulares marcados com letras maiúsculas. As colunas representam o escore z dos valores de expressão gênicat -ΔΔC em uma escala de cores de -1 a +1 para esse gene nessa amostra. Os agrupamentos de genes são rotulados por número. Este número foi modificado de O'Sullivan et al. 202116. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: Expressão gênica do safenótipo em amostras neuronais enriquecidas com GLP-1. Os diagramas celulares exibem caixas que representam a expressão gênica relativa (escore z médio dos valorest de -ΔΔC) dos subfenótipos mostrados no mapa de calor da Figura 4. Os diagramas foram construídos utilizando o Cytoscape versão 3.8.0 e os escores-z foram calculados utilizando a função de escala no R versão 3.5.2. -Os rótulos ΔΔCt à direita mostram quais caixas correspondem a qual gene e a cor representam a expressão (azul é baixa expressão e amarelo é alta expressão). A localização da caixa representa a localização ou função do produto proteico desse transcrito genético. Os números verdes indicam subgrupos dentro dos subfenótipos. Este número foi modificado de O'Sullivan et al. 202116. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6: Circuito vagal interoceptivo, neuraxia visceral-emocional e esquema do modelo de dependência do processo adversário. (A) Os aferentes vagais interoceptivos retransmitem o estado do intestino, que é altamente influenciado pela microflora intestinal e outros órgãos periféricos para o núcleo do trato solitário (NTS). Esta informação é posteriormente transmitida para a amígdala e influencia os estados emocionais. (B) Uma representação simplificada de desenho animado mostrando os papéis integrativos do núcleo do trato solitário (NTS) e do núcleo central da amígdala (CeA) na emoção, estresse e regulação autonômica. Dois subtipos neuronais, GLP-1 e neurônios NE são destacados. Muitas conexões anatômicas e funcionais são omitidas para maior clareza. Abreviaturas: NE = norepinefrina; GLP-1 = peptídeo 1 semelhante ao glucagon; GABA = ácido γ-aminobutírico; Eixo HPA = eixo hipotálamo-hipófise-adrenal; IRC = hormônio liberador de corticotropina. (C) A exposição ao álcool e/ou opioides tem duas ações: estimular a recompensa, através da via mesolímbica da dopamina, e inibir a anti-recompensa. Essas ações motivam o uso de substâncias por meio de reforço positivo. (D) A abstinência de álcool e/ou opioides tem duas ações: inibir a recompensa, inibindo a via mesolímbica da dopamina (não mostrada) e estimular a anti-recompensa. Este estudo propõe que a neuroinflamação visceral-emocional é um ponto final na estimulação anti-recompensa, embora essa hipótese justifique mais testes. Essas ações, qualquer que seja o mecanismo, motivam a dependência de substâncias por meio de reforço negativo. Este número foi modificado de O'Sullivan et al. 202116. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela Suplementar 1: Primers para RT-qPCR microfluídica. Todos os pares de iniciadores para amplificação de mRNA são listados juntamente com o comprimento do amplificador formado por cada par de iniciadores. Esta tabela foi modificada de O'Sullivan et al. 202116. Clique aqui para baixar este arquivo.

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Discussion

O transtorno por uso de álcool continua sendo uma doença desafiadora para tratar. Nosso grupo abordou esse distúrbio investigando processos anti-recompensa com uma perspectiva de neurociência de sistemas. Medimos as alterações na expressão gênica em neurônios NTS únicos e microglia em uma série temporal de abstinência alcoólica16. O NTS foi escolhido por seu papel proeminente na desregulação autonômica que ocorre na síndrome de abstinência alcoólica. Combinamos LCM com RT-qPCR microfluídica de célula única, permitindo que um número robusto de amostras e genes seja medido a baixo custo com sensibilidade e especificidade anatômica e molecular (Figura 1B-C). As células únicas foram identificadas e selecionadas por coloração IHC, e esses agrupamentos de subfenótipos celulares foram validados com expressão molecular (Figura 1D-E). No entanto, algumas amostras neuronais enriquecidas com GLP-1 (neurônios TH-) expressaram moderadamente Th (Figura 4). O estabelecimento do fenótipo celular foi feito na seleção celular com base na visualização fluorescente, e esse critério foi utilizado para o estudo como agrupamento molecular baseado na expressão de um único gene, Th, não conseguiu definir padrões de expressão sugestivos de um fenótipo celular16. Assim, os resultados caracterizam os principais subfenótipos microgliais e neuronais do SNT e sua dinâmica na abstinência alcoólica.

Este manuscrito descreve um método para transcriptômica de célula única, e é imperativo que todas as etapas do protocolo sejam seguidas conforme descrito. Alguma modificação pode ser necessária ao trabalhar com diferentes tecidos de órgãos ou tipos de células. Um dos desafios deste protocolo é manter a qualidade e a integridade do RNA durante a LCM. Estabelecemos protocolos para coloração IHC, LCM e RT-qPCR microfluídica para enfrentar os desafios, conforme detalhado acima. Resumidamente, esses processos incluem a adição de inibidor de RNase a todas as soluções de coloração para evitar a degradação do RNA, um protocolo de coloração rápida para evitar uma possível degradação do RNA, o processamento de lâminas para LCM imediatamente após a coloração e desidratação do IHC e a manutenção de condições de frio adequadas sempre que possível durante o processamento ou transferência da amostra.

O ensaio transcriptômico é realizado em células isoladas lisadas sem isolamento de RNA, seguido de transcrição reversa, pré-amplificação e qPCR. A etapa de pré-amplificação é amplificar as moléculas de cDNA para níveis detectáveis para qPCR seletivamente. Existem várias limitações para a etapa de pré-amplificação. Estes incluem transcritos de genes que não conseguem ser amplificados, o que resultará em nenhuma detecção em RT-qPCR microfluídica. Há também a possibilidade de formação de dímero de primer, pois a reação de PCR contém todos os primers para o ensaio experimental. Ou seja, é possível a formação de dímeros com uma sequência para frente e para trás de um único par de primer e com todas as sequências para frente e para trás no experimento. Portanto, o teste de primer usando controle experimental positivo, como padrões de RNA, é aconselhável.

O design do chip RT-qPCR é outro aspecto crucial deste protocolo para controle de qualidade e efeitos de lote. Os controles positivos consistem em RNA padrão do animal e do órgão que está sendo ensaiado (cérebro de rato neste exemplo representativo). Uma série de diluição de RNA pode então ser carregada em cada chip e deve demonstrar o sinal quantitativo apropriado para cada gene ensaiado. A água pode ser usada como um controle negativo. Esses controles são críticos para a normalização adequada que controla os efeitos de lote que podem ocorrer ao combinar dados de diferentes chips. Isso é discutido em detalhes na etapa 8.

No experimento representativo mostrado aqui, esses métodos foram aplicados para gerar hipóteses e fornecer informações sobre possíveis mecanismos. O estudo foi realizado no contexto de outro trabalho e fornece informações importantes para a hipótese antirecompensa interceptiva13. Em resumo, este modelo conjectura que o anti-recompensa é estimulado na retirada de substâncias pela sinalização interoceptiva do vago via NTS para a amígdala e que o substrato inicial deste anti-recompensa é a neuroinflamação (Figura 6). Este trabalho apoia essa hipótese estabelecendo as alterações inflamatórias na expressão gênica em neurônios e micróglias após a abstinência de álcool.

Uma grande fraqueza deste estudo é a sua falta de alegações mecanicistas. No entanto, esses métodos podem ser usados para determinar um mecanismo após a realização de um experimento de linha de base como este. Por exemplo, uma intervenção ou perturbações de modelo animal, como uma vagotomia subdiafragmática ou nocaute genético, podem demonstrar mecanismos anatômicos ou genéticos de reguladores inflamatórios. Estudos futuros que adotem essa abordagem podem contribuir para o desenvolvimento da hipótese interoceptiva antirecompensa, que visa implementar esses insights na prática clínica para o tratamento da dependência.

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Disclosures

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Acknowledgments

O trabalho aqui apresentado foi financiado através do NIH HLB U01 HL133360 concedido a JS e RV, NIDA R21 DA036372 concedido a JS e EVB, T32 AA-007463 concedido a Jan Hoek em apoio ao SJO'S, e Instituto Nacional de Alcoolismo e Abuso de Álcool: R01 AA018873.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
20X DNA Binding Dye Fluidigm 100-7609 NA
2x GE Assay Loading Reagent Fluidigm 85000802-R NA
96.96 Dynamic Array IFC for Gene Expression (referred to as qPCR chip in text) Fluidigm BMK-M-96.96 NA
Anti-Cd11β Antibody Genway Biotech CCEC48 Microglia Stain
Anti-NeuN Antibody, clone A60 EMD Millipore MAB377 Neuronal Stain
Anti-tyrosine hydroxylase antibody abcam ab112 Stain for TH+ neurons
ArcturusXT Laser Capture Microdissection System Arcturus NA NA
Biomark HD Fluidigm NA RT-qPCR platform
Bovine Serum Antigen Sigma-Aldrich B4287
CapSure Macro LCM Caps ThermoFisher Scientific  LCM0211 NA
CellDirect One-Step qRT-PCR Kit ThermoFisher Scientific 11753500 Lysis buffer solution components
CellsDirect Resuspension & Lysis Buffer Kit ThermoFisher Scientific 11739010 Invitrogen
DAPI ThermoFisher Scientific 62248 Nucleus Stain
DNA Suspension Buffer TEKnova T0221
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) ReadyProbe Secondary Antibody, Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) ReadyProbe Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 ThermoFisher Scientific R37118 Seconadry Antibody
Exonuclease I New Englnad BioLabs, Inc. M0293S NA
ExtracSure Sample Extraction Device ThermoFisher Scientific LCM0208 NA
FisherbrandTM Superfrost Plus Microscope Slides ThermoFisher Scientific 22-037-246 Plain glass slides
GeneAmp Thin-Walled Reaction Tube ThermoFisher Scientific N8010611
Goat anti-Mouse IgG (H+L), Superclona Recombinant Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 ThermoFisher Scientific A28180 Seconadry Antibody
IFC Controller Fluidigm NA NA
RNaseOut ThermoFisher Scientific 10777019
SsoFast EvaGreen Supermix with Low Rox Bio-Rad PN 172-5211 NA
SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit ThermoFisher Scientific 11754250 Contains VILO and SuperScript
T4 Gene 32 Protein New Englnad BioLabs, Inc. M0300S NA
TaqMan PreAmp Master Mix ThermoFisher Scientific 4391128 NA
TE Buffer TEKnova T0225 NA
TempPlate Semi-Skirted 96-Well PCR Plate, 0.2 mL USA Scientific 1402-9700 NA

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References

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