Микротрансплантация синаптических мембран для реактивации синаптических рецепторов человека для функциональных исследований
Summary
Протокол демонстрирует, что, выполняя микротрансплантацию синаптических мембран в ооциты Xenopus laevis , можно регистрировать последовательные и надежные ответы рецепторов α-амино-3-гидрокси-5-метил-4-изоксазолпропионовой кислоты и γ-аминомасляной кислоты.
Abstract
Возбуждающие и ингибирующие ионотропные рецепторы являются основными воротами потоков ионов, определяющих активность синапсов при физиологической нейронной коммуникации. Таким образом, изменения в их изобилии, функции и отношениях с другими синаптическими элементами наблюдались как основной коррелят изменений в функции мозга и когнитивных нарушений при нейродегенеративных заболеваниях и психических расстройствах. Понимание того, как функция возбуждающих и тормозных синаптических рецепторов изменяется болезнью, имеет решающее значение для разработки эффективных методов лечения. Чтобы получить информацию, относящуюся к заболеванию, важно регистрировать электрическую активность рецепторов нейротрансмиттеров, которые остаются функциональными в больном мозге человека. Пока это самый близкий подход к оценке патологических изменений в функции рецепторов. В данной работе представлена методика выполнения микротрансплантации синаптических мембран, которая заключается в реактивации синаптических мембран из замороженной ткани головного мозга человека, содержащей рецепторы человека, путем ее введения и заднего слияния в мембрану ооцитов Xenopus laevis . Протокол также обеспечивает методологическую стратегию получения последовательных и надежных ответов рецепторов α-амино-3-гидрокси-5-метил-4-изоксазолпропионовой кислоты (AMPA) и γ-аминомасляной кислоты (ГАМК), а также новые подробные методы, которые используются для нормализации и тщательного анализа данных.
Introduction
Нейродегенеративными расстройствами страдает большой процент населения. Хотя их разрушительные последствия хорошо известны, связь между функциональными изменениями рецепторов нейротрансмиттеров, которые имеют решающее значение для функции мозга, и их симптоматикой все еще плохо изучена. Межиндивидуальная изменчивость, хронический характер заболевания и коварное появление симптомов — это лишь некоторые из причин, которые задержали понимание многих заболеваний головного мозга, где химический дисбаланс хорошо задокументирован 1,2. Животные модели генерировали бесценную информацию и расширили наши знания о механизмах, лежащих в основе физиологии и патофизиологии в эволюционно-консервативных системах; однако несколько межвидовых различий между грызунами и людьми исключают прямую экстраполяцию функции рецепторов от животных моделей к человеческому мозгу3. Таким образом, первоначальные усилия по изучению нативных рецепторов человека были разработаны лабораторией Рикардо Миледи с использованием хирургически удаленной ткани и замороженных образцов. В этих первоначальных экспериментах использовались целые мембраны, которые включают нейрональные синаптические и экстрасинаптические рецепторы, а также ненейрональные нейротрансмиттерные рецепторы, и хотя они предоставляют важную информацию о болезненных состояниях, существует опасение, что сочетание рецепторов усложняет интерпретацию данных 4,5,6,7. Важно отметить, что синапсы являются основной мишенью при многих нейродегенеративных расстройствах 8,9; поэтому анализы для проверки функциональных свойств пораженных синапсов имеют основополагающее значение для получения информации о связанных с заболеванием изменениях, влияющих на синаптическую связь. Здесь описана модификация оригинального метода: микротрансплантация синаптических мембран (МСМ), которая фокусируется на физиологической характеристике обогащенных синаптических белковых препаратов и успешно применяется для изучения синаптосом крыс и человека 10,11,12,13,14,15 . С помощью этой методологии можно трансплантировать синаптические рецепторы, которые когда-то работали в человеческом мозге, встроенные в их собственные нативные липиды и в их собственную когорту связанных белков. Более того, поскольку данные МСМ являются количественными, можно использовать эти данные для интеграции с большими протеомными или секвенирующими наборами данных10.
Важно отметить, что многие фармакологические и биофизические анализы синаптических рецепторов проводятся на рекомбинантных белках16,17. Хотя этот подход обеспечивает лучшее понимание структурно-функциональных отношений рецепторов, он не может предоставить информацию о сложных многомерных рецепторных комплексах, обнаруженных в нейронах, и их изменениях при заболевании. Поэтому комбинация нативных и рекомбинантных белков должна обеспечить более комплексный анализ синаптических рецепторов.
Существует множество методов получения синаптосом 10,11,12,13,14,15, которые могут быть скорректированы с учетом требований лаборатории. Протокол начинается с предположения, что синаптосомно-обогащенные препараты были выделены и готовы к переработке для экспериментов по микротрансплантации. В лаборатории используется метод Syn-Per в соответствии с инструкциями производителя. Сделано это из-за высокой воспроизводимости в электрофизиологических экспериментах10,11. Существует также обильная литература, объясняющая, как выделить ооциты Xenopus 18,19, которые также можно приобрести готовыми к инъекции20.
Protocol
Representative Results
Discussion
Анализ нативных белковых комплексов из мозга человека необходим для понимания гомеостатических и патологических процессов при заболеваниях головного мозга и разработки терапевтических стратегий профилактики или лечения заболеваний. Таким образом, банки мозга, содержащие заморожен…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грантами NIA/NIH R01AG070255 и R01AG073133 для AL. Мы также благодарим Исследовательский центр болезни Альцгеймера Калифорнийского университета в Ирвине (UCI-ADRC) за предоставление тканей человека, показанных в этой рукописи. UCI-ADRC финансируется грантом NIH/NIA P30 AG066519.
Materials
| For Microinjection | |||
| 3.5" Glass Capillaries | Drummond | 3-000-203-G/X | |
| 24 well, flat bottom Tissue Culture Plate | Thermofisher | FB012929 | |
| Flaming/Brown type micropipette puller | Sutter | P-1000 | |
| Injection Dish | Thermofisher | 08-772B | |
| Microcentrifuge Tubes | Thermofisher | 02-682-002 | |
| Mineral Oil | Thermofisher | O121-1 | |
| Nanoject II | Drummond | 3-000-204 | |
| Nylon mesh | Industrial Netting | WN0800 | |
| Parafilm | Thermofisher | S37440 | |
| Stereoscope | Fisher Scientific | 03-000-037 | |
| Syringe | Thermofisher | 14-841-31 | |
| Ultrasonic cleaning bath | Thermofisher | FS20D | |
| Xenopus laevis frogs | Xenopus 1 | 4217 | |
| For Two Electrode Voltage clamp | |||
| 15 cm long fire polished borosilicate glass capillaries | Sutter | B200-116-15 | |
| Any PC computer or laptop | |||
| Low-pass Bessel Filter | Warner Instruments | LPF-8 | |
| Stereoscope | Fisher Scientific | 03-000-037 | |
| Two electrode voltage clamp workstation | Warner Instruments | TEV-700 | |
| ValveLink 8.2 Perfusion Controller | Automate Scientific | SKU:01-18 | |
| WInEDR Free software | University of Strathclyde Glasgow | https://spider.science.strath.ac.uk/sipbs/software_ses.htm | |
| X Series Multifunction DAQ | National Instruments | NI USB-6341 | |
| Reagents | |||
| Calcium dichloride | Thermofisher | C79 | |
| Calcium nitrate tetrahydrate | Thermofisher | C109 | |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | C0130 | |
| GABA | Sigma-Aldrich | A2129 | |
| HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) | Thermofisher | BP310 | |
| Kainic acid | Tocris | 0222 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Thermofisher | M63 | |
| Potassium chloride | Thermofisher | P217 | |
| Sodium bicarbonate | Thermofisher | S233 | |
| Sodium chloride | Thermofisher | S271-1 | |
| Ultrafree-0.1 µm MC filter, | Amicon |
References
- Furcila, D., Defelipe, J., Alonso-Nanclares, L. A study of amyloid-β and phosphotau in plaques and neurons in the hippocampus of Alzheimer’s disease patients. Journal of Alzheimer’s Disease. 64 (2), 417-435 (2018).
- Varol, E., Sotiras, A., Davatzikos, C. HYDRA: revealing Heterogeneity of imaging and genetic patterns through a multiple max-margin discriminative analysis framework. Neuroimaje. 145, 346-364 (2017).
- Hodge, R. v. D., et al. Conserved cell types with divergent features in human versus mouse cortex. Nature. 573 (7772), 61-68 (2019).
- Wu, J., et al. GABAA receptor-mediated excitation in dissociated neurons from human hypothalamic hamartomas. Experimental Neurology. 213 (2), 397-404 (2008).
- Miledi, R., Eusebi, F., Martínez-Torres, A., Palma, E., Trettel, F. Expression of functional neurotransmitter receptors in Xenopus oocytes after injection of human brain membranes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (20), 13238-13242 (2002).
- Zwart, R., Mazzo, F., Sher, E. Microtransplantation of human brain receptors into oocytes to tackle key questions in drug discovery. Drug Discovery Today. 24 (2), 533-543 (2019).
- Limon, A., Reyes-Ruiz, J. M., Miledi, R. Microtransplantation of neurotransmitter receptors from postmortem autistic brains to Xenopus oocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (31), 10973-10977 (2008).
- Bae, J. R., Kim, S. H. Synapses in neurodegenerative diseases. BMB Reports. 50 (5), 237-246 (2017).
- Taoufik, E., Kouroupi, G., Zygogianni, O., Matsas, R. Synaptic dysfunction in neurodegenerative and neurodevelopmental diseases: An overview of induced pluripotent stem-cell-based disease models. Open Biology. 8 (9), 180138 (2018).
- Zeppillo, T., et al. Functional impairment of cortical AMPA receptors in schizophrenia. Schizophrenia Research. , (2020).
- Lauterborn, J. C., et al. Increased excitatory to inhibitory synaptic ratio in parietal cortex samples from individuals with Alzheimer’s disease. Nature Communications. 12 (1), 2603 (2021).
- Mazzo, F., et al. Reconstitution of synaptic Ion channels from rodent and human brain in Xenopus oocytes: a biochemical and electrophysiological characterization. Journal of Neurochemistry. 138 (3), 384-396 (2016).
- Sanna, E., et al. Expression of native GABA(A) receptors in Xenopus oocytes injected with rat brain synaptosomes. Journal of Neurochemistry. 67 (5), 2212-2214 (1996).
- Sanna, E., et al. Functional changes in rat nigral GABA(A) receptors induced by degeneration of the striatonigral GABAergic pathway: An electrophysiological study of receptors incorporated into Xenopus oocytes. Journal of Neurochemistry. 70 (6), 2539-2544 (1998).
- Sandoval, M., et al. Antagonistic effects of TrkB and p75NTR on NMDA receptor currents in post-synaptic densities transplanted into Xenopus oocytes. Journal of Neurochemistry. 101 (6), 1672-1684 (2007).
- Perrais, D., Pinheiro, P. S., Jane, D. E., Mulle, C. Antagonism of recombinant and native GluK3-containing kainate receptors. Neuropharmacology. 56 (1), 131-140 (2009).
- Zhao, Y., Chen, S., Swensen, A. C., Qian, W. J., Gouaux, E. Architecture and subunit arrangement of native AMPA receptors elucidated by cryo-EM. Science. 364 (6438), 355-362 (2019).
- Bröer, S. Xenopus laevis Oocytes. Membrane Transporters in Drug Discovery and Development: Methods and Protocols. , 295-310 (2010).
- Newman, K., Aguero, T., King, M. Lou Isolation of xenopus oocytes. Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (2), 86-91 (2018).
- Lin-Moshier, Y., Marchant, J. S. The Xenopus oocyte: A single-cell model for studying Ca2+ signaling. Cold Spring Harbor Protocols. 8 (3), 185-191 (2013).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Microinjection of Xenopus oocytes. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (12), (2010).
- Eusebi, F., Palma, E., Amici, M., Miledi, R. Microtransplantation of ligand-gated receptor-channels from fresh or frozen nervous tissue into Xenopus oocytes: A potent tool for expanding functional information. Progress in Neurobiology. 88 (1), 32-40 (2009).
- Marsal, J., Tigyi, G., Miledi, R. Incorporation of acetylcholine receptors and Cl- channels in Xenopus oocytes injected with Torpedo electroplaque membranes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (11), 5224-5228 (1995).
- Cutting, G. R., et al. Cloning of the γ-aminobutyric acid (GABA) ρ1 cDNA: A GABA receptor subunit highly expressed in the retina. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (7), 2673-2677 (1991).
- Calvo, D. J., Vazquez, A. E., Miledi, R. Cationic modulation of ρ1-type γ-aminobutyrate receptors expressed in Xenopus oocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (26), 12725-12729 (1994).
- Martínez-Torres, A., Miledi, R. Expression of γ-aminobutyric acid ρ1 and ρ1Δ450 as gene fusions with the green fluorescent protein. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (4), 1947-1951 (2001).
- Ochoa-De La Paz, L. D., Estrada-Mondragón, A., Limón, A., Miledi, R., Martínez-Torres, A. Dopamine and serotonin modulate human GABAρ1 receptors expressed in Xenopus laevis oocytes. ACS Chemical Neuroscience. 3 (2), 96-104 (2012).
- Limon, A., Reyes-Ruiz, J. M., Eusebi, F., Miledi, R. Properties of GluR3 receptors tagged with GFP at the amino or carboxyl terminus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (39), 15526-15530 (2007).
- C, S. N. A Rosetta stone for analysis of human membrane protein function. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (31), 10641-10642 (2008).
- Eleonora, P., et al. GABAA-current rundown of temporal lobe epilepsy is associated with repetitive activation of GABAA "phasic" receptors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (52), 20944-20948 (2007).
- Bond, B. C., et al. The quantification of gene expression in an animal model of brain ischaemia using TaqManTM real-time RT-PCR. Molecular Brain Research. 106 (1-2), 101-116 (2002).
- Preece, P., Cairns, N. J. Quantifying mRNA in postmortem human brain: influence of gender, age at death, postmortem interval, brain pH, agonal state and inter-lobe mRNA variance. Molecular Brain Research. 118 (1-2), 60-71 (2003).
- Preece, P., et al. An optimistic view for quantifying mRNA in post-mortem human brain. Molecular Brain Research. 116 (1-2), 7-16 (2003).
- Stan, A. D., et al. Human postmortem tissue: What quality markers matter. Brain Research. 1123 (1), 1-11 (2006).
- Scaduto, P., Sequeira, A., Vawter, M. P., Bunney, W., Limon, A. Preservation of global synaptic excitatory to inhibitory ratio during long postmortem intervals. Scientific Reports. 10 (1), 1-8 (2020).
- Marsal, J., Tigyi, G., Miledi, R. Incorporation of acetylcholine receptors and Cl- channels in Xenopus oocytes injected with Torpedo electroplaque membranes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (11), 5224-5228 (1995).
- Le Mauff, A., et al. Nicotinic acetylcholine receptors in the synganglion of the tick Ixodes ricinus: Functional characterization using membrane microtransplantation. International Journal for Parasitology: Drugs and Drug Resistance. 14, 144-151 (2020).
- Crespin, L., Legros, C., List, O., Tricoire-Leignel, H., Mattei, C. Injection of insect membrane in Xenopus oocyte: An original method for the pharmacological characterization of neonicotinoid insecticides. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 77, 10-16 (2016).
- Soualah, Z., et al. GABAA Receptor Subunit Composition Drives Its Sensitivity to the Insecticide Fipronil. Frontiers in Neuroscience. 15, 1-13 (2021).
- Symington, S. B., Murenzi, E., Toltin, A. C., Lansky, D., Clark, J. M. Realizing the potential: improving a microtransplantation assay based on neurolemma-injected Xenopus oocytes: an ex vivo approach to study ion channels in their native state. ACS Symposium Series. 1264, 53-73 (2017).
- Palma, E., et al. Microtransplantation of membranes from cultured cells to Xenopus oocytes: A method to study neurotransmitter receptors embedded in native lipids. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (5), 2896-2900 (2003).
