JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biology

שימוש בנתונים של תולעת בודדת כדי לכמת את ההטרוגניות באינטראקציות של Caenorhabditis elegans-Bacterial

Published: July 22, 2022
doi:
10.3791/64027
, ,
1Department of Biology,Emory University, 2Department of Physics,Emory University

Summary

פרוטוקול זה מתאר שיבוש של 96 קידוחים של קאנורהבדיטיס אלגאן (Caenorhabditis elegans ) המיושבים בחיידקים בעקבות שיתוק קר והלבנת פני השטח כדי לסלק חיידקים חיצוניים. התרחיף המתקבל מצופה על לוחות אגר כדי לאפשר כימות מדויק בתפוקה בינונית של עומס חיידקים במספר גדול של תולעים בודדות.

Abstract

הנמטודה Caenorhabditis elegans היא מערכת מודל לאינטראקציות בין פונדקאי למיקרוב ולמיקרוביום מארח-מיקרוביום. מחקרים רבים עד כה משתמשים בתקצירי אצווה ולא בדגימות תולעים בודדות כדי לכמת את עומס החיידקים באורגניזם זה. כאן נטען כי השונות הבין-אישית הגדולה הנראית בהתיישבות חיידקית במעי C. elegans היא אינפורמטיבית, וכי שיטות העיכול של האצווה משליכות מידע החשוב להשוואה מדויקת בין תנאים. מכיוון שתיאור השונות הטבועה בדגימות אלה דורש מספר רב של פרטים, נקבע פרוטוקול נוח של לוחות 96 בארות לשיבוש וציפוי מושבה של תולעים בודדות.

Introduction

הטרוגניות באסוציאציות בין חיידקים מארחים נצפית בכל מקום, ושונות בין פרטים מוכרת יותר ויותר כגורם תורם בתהליכים ברמת האוכלוסייה מתחרות ודו-קיום1 ועד העברת מחלות 2,3,4. ב– C. elegans, “הטרוגניות נסתרת” בתוך אוכלוסיות איזוגניות נצפתה שוב ושוב, כאשר תת-אוכלוסיות של פרטים הראו פנוטיפים שונים בתגובת הלם חום 5,6, הזדקנות ותוחלת חיים 7,8,9,10,11, והיבטים רבים אחרים של פיזיולוגיה ופיתוח12 . רוב הניתוחים המנסים לזהות מבנה תת-אוכלוסייה מספקים ראיות לשתי תת-אוכלוסיות באוכלוסיות ניסיוניות של תולעים איזוגניות ומסונכרנות 5,7,8, אם כי נתונים אחרים מצביעים על האפשרות של התפלגות בתוך האוכלוסייה של תכונות ולא קבוצות מובחנות 7,12,13 . רלוונטי כאן, הטרוגניות משמעותית באוכלוסיות מעיים נצפית אפילו בתוך אוכלוסיות איזוגניות של תולעים המיושבות ממקור משותף של מיקרובים 13,14,15,16, והטרוגניות זו יכולה להיות מוסתרת על ידי מדידות תקציר אצווה הנמצאות בשימוש נרחב 17,18,19,20 לכימות חיידקים בתולעת.

עבודה זו מציגה נתונים המצביעים על צורך בהסתמכות רבה יותר על מדידות של תולעים בודדות בקשר בין מיקרובים מארחים, כמו גם פרוטוקולים להגברת הדיוק והתפוקה בהפרעה לתולעת בודדת. פרוטוקולים אלה נועדו להקל על הפרעה מכנית של מספר גדול של C. elegans בודדים לכימות של עומס חיידקי בר-קיימא, תוך מתן יכולת חזרה טובה יותר ומאמץ נמוך יותר לכל דגימה מאשר הפרעה מבוססת מזיקים של תולעים בודדות. שלב מומלץ לטיהור המעיים, שבו תולעים מורשות להיזון מאי קולי מומת בחום לפני ההכנה לשיבוש, נכלל כדי למזער את התרומות של חיידקים ארעיים (שאינם דבקים) שנבלעו לאחרונה ואחרים (שאינם דבקים). פרוטוקולים אלה כוללים שיטת שיתוק קר לניקוי הציפורן עם טיפול באקונומיקה משטח בריכוז נמוך; הלבנת פני השטח יכולה לשמש כשלב הכנה בהפרעה לתולעת בודדת או כשיטה להכנת תולעים חיות, נטולות חיידקים מבחוץ. שיטת הלבנת פני השטח הזו מספיקה כדי להסיר מגוון רחב של חיידקים חיצוניים, וטיפול בקור מספק אלטרנטיבה לשיתוק קונבנציונלי מבוסס לבאמיזול; בעוד ש-levamisole יהיה מועדף לניסויים רגישים לקור, שיתוק קר ממזער את התרומות לזרמי פסולת מסוכנים ומאפשר חידוש מהיר של פעילות תקינה. בעוד שהפרוטוקול המלא מתאר ניסוי מעבדה שבו תולעים מתיישבות עם חיידקים ידועים, ההליכים לניקוי תולעים ושיבוש תולעים בודדות יכולים להיות מיושמים בקלות על תולעים שבודדו מדגימות בר או התיישבו בניסויי מיקרוקוסמוס. הפרוטוקולים המתוארים כאן מייצרים חיידקים חיים המופקים ממעי התולעת, המתאימים לציפוי ולכימות של יחידות יוצרות מושבה (CME) בתולעים בודדות; לצורך ניתוח קהילת המעיים המבוסס על ריצוף, יש להוסיף לפרוטוקולים אלה את שלבי התזה התאית ומיצוי חומצות הגרעין הבאים.

Protocol

תולעים ששימשו בניסויים אלה התקבלו מהמרכז הגנטי Caenorhabditis , הממומן על ידי המשרד לתוכניות תשתית מחקר של NIH (P40 OD010440). בריסטול N2 הוא הסוג הפראי. המוטנטים DAF-2/IGF daf-16(mu86) I (CGC CF1038) ו-daf-2(e1370) III (CGC CB1370) משמשים להמחשת הבדלים בעומס חיידקי במעיים. HT115(DE3) E. coli הנושא את וקטור RNA…

Representative Results

עיקור אקונומיקה של תולעים חיותתולעים מולבנות על פני השטח נקיות למעשה מחיידקים חיצוניים עד שהתנועתיות חוזרת וההפרשה מתחדשת. בתנאים המשמשים כאן, נצפית הכחדה מהירה של חיידקים במאגר (איור 1A-C, איור משלים 2, וידאו 1) מבלי להפריע לחיידקים הקשורים למע?…

Discussion

כאן מוצגים נתונים על היתרונות של כימות תולעת בודדת של עומס חיידקים ב- C. elegans, יחד עם פרוטוקול שיבוש של 96 בארות כדי לאפשר רכישה מהירה ועקבית של מערכי נתונים גדולים מסוג זה. בהשוואה לשיטות הקיימות33, פרוטוקולים אלה מאפשרים מדידה בתפוקה גבוהה יותר של קהילות מיקרוביאליות במעיי…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

המחברים רוצים להודות ל-H. Schulenberg ול-C. LaRock על השיתוף הנדיב שלהם בזני חיידקים ששימשו בניסויים אלה. עבודה זו נתמכה על ידי מימון מאוניברסיטת אמורי ו- NSF (PHY2014173).

Materials

96-well flat-bottom polypropylene plates, 300 uL Evergreen Labware 290-8350-03F
96-well plate sealing mat, silicon, square wells (AxyMat) Axygen AM-2ML-SQ
96-well plates, 2 mL, square wells Axygen P-2ML-SQ-C-S
96-well polypropylene plate lids Evergreen Labware 290-8020-03L
Agar Fisher Scientific 443570050
Bead mill adapter set for 96-well plates QIAGEN 119900 Adapter plates for use with two 96-well plates on the TissueLyser II
Bead mill tissue homogenizer (TissueLyser II) QIAGEN 85300 Mechanical homogenizer for medium to high-throughput sample disruption
BioSorter Union Biometrica By quotation Large object sorter equipped with a 250 micron focus for C. elegans
Bleach, commercial, 8.25% sodium hypochlorite Clorox
Breathe-Easy 96-well gas permeable sealing membrane Diversified Biotech BEM-1 Multiwell plate gas permeable polyurethane membranes. Thin sealing film is permeable to O2, CO2, and water vapors and is UV transparent down to 300 nm. Sterile, 100/box.
Calcium chloride dihydrate Fisher Scientific AC423525000
Cholesterol VWR AAA11470-30
Citric acid monohydrate Fisher Scientific AC124910010
Copper (II) sulfate pentahydrate Fisher Scientific AC197722500
Corning 6765 LSE Mini Microcentrifuge Corning  COR-6765
Disodium EDTA Fisher Scientific 409971000
DL 1,4 Dithiothreitol, 99+%, for mol biology, DNAse, RNAse and Protease free, ACROS Organics Fisher Scientific 327190010
Eppendorf 1.5 mL microcentrifuge tubes, natural Eppendorf
Eppendorf 5424R microcentrifuge Eppendorf 5406000640 24-place refrigerated benchtop microcentrifuge
Eppendorf 5810R centrifuge with rotor S-4-104 Eppendorf 22627040 3L benchtop centrifuge with adaptors for 15-50 mL tubes and plates
Eppendorf plate bucket (x2), for Rotor S-4-104 Eppendorf 22638930
Ethanol 100% Fisher Scientific BP2818500
Glass beads, 2.7 mm Life Science Products LS-79127
Glass beads, acid-washed, 425-600 µm Sigma G877-500G
Glass plating beads VWR 76005-124
Hydrochloric acid VWR BDH7204-1
Iron (II) sulfate heptahydrate Fisher Scientific 423731000
Kimble Kontes pellet pestle motor DWK Life Sciences 749540-0000
Kimble Kontes polypropylene pellet pestles and microtubes, 0.5 mL DWK Life Sciences 749520-0590
Leica DMi8 motorized inverted microscope with motorized stage Leica 11889113
Leica LAS X Premium software Leica 11640687
Magnesium sulfate heptahydrate Fisher Scientific AC124900010
Manganese(II) chloride tetrahydrate VWR 470301-706
PARAFILM M flexible laboratory sealing film Amcor PM996
Peptone Fisher Scientific BP1420-500
Petri dishes, round, 10 cm VWR 25384-094
Petri dishes, round, 6 cm VWR 25384-092
Petri dishes, square, 10 x 10 cm VWR 10799-140
Phospho-buffered saline (1X PBS) Gold Bio P-271-200
Polypropylene autoclave tray, shallow Fisher Scientific 13-361-10
Potassium hydroxide Fisher Scientific AC134062500
Potassium phosphate dibasic Fisher Scientific BP363-1
Potassium phosphate monobasic Fisher Scientific BP362-1
R 4.1.3/RStudio 2022.02.0 build 443 R Foundation n/a
Scoop-type laboratory spatula, metal VWR 470149-438
Silicon carbide 36 grit MJR Tumblers n/a Black extra coarse silicon carbide grit. Available in 0.5-5 lb sizes from this vendor.
Sodium dodecyl sulfate Fisher Scientific BP166-100
Sodium hydroxide VWR BDH7247-1
Sodium phosphate dibasic anhydrous Fisher Scientific BP332-500
Sodum chloride Fisher Scientific BP358-1
Sucrose Fisher Scientific AC419760010
Tri-potassium citrate monohydrate Fisher Scientific AC611755000
Triton X-100 Fisher Scientific BP151-100
Zinc sulfate heptahydrate Fisher Scientific AC205982500
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Armitage, D. W., Jones, S. E. How sample heterogeneity can obscure the signal of microbial interactions. The ISME Journal. 13 (11), 2639-2646 (2019).
  2. Stephenson, J., et al. Host heterogeneity affects both parasite transmission to and fitness on subsequent hosts. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 372 (1719), 20160093 (2017).
  3. VanderWaal, K. L., Ezenwa, V. O. Heterogeneity in pathogen transmission: mechanisms and methodology. Functional Ecology. 30 (10), 1606-1622 (2016).
  4. Dwyer, G., Elkinton, J. S., Buonaccorsi, J. P. Host heterogeneity in susceptibility and disease dynamics: tests of a mathematical model. The American Naturalist. 150 (6), 685-707 (1997).
  5. Wu, D., Rea, S. L., Yashin, A. I., Johnson, T. E. Visualizing hidden heterogeneity in isogenic populations of C. elegans. Experimental Gerontology. 41 (3), 261-270 (2006).
  6. Yashin, A. I., et al. Heat shock changes the heterogeneity distribution in populations of Caenorhabditis elegans does it tell us anything about the biological mechanism of stress response. The Journals of Gerontology Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 57 (3), 83-92 (2002).
  7. Zhao, Y., et al. Two forms of death in ageing Caenorhabditis elegans. Nature Communications. 8 (1), 1-8 (2017).
  8. Eckley, D. M., et al. Molecular characterization of the transition to mid-life in Caenorhabditis elegans. AGE. 35 (3), 689-703 (2012).
  9. Rea, S. L., Wu, D., Cypser, J. R., Vaupel, J. W., Johnson, T. E. A stress-sensitive reporter predicts longevity in isogenic populations of Caenorhabditis elegans. Nature Genetics. 37 (8), 894-898 (2005).
  10. Kinser, H. E., Mosley, M. C., Plutzer, I. B., Pincus, Z. Global, cell non-autonomous gene regulation drives individual lifespan among isogenic C. elegans. eLife. , (2021).
  11. Churgin, M. A., et al. Longitudinal imaging of Caenorhabditis elegans in a microfabricated device reveals variation in behavioral decline during aging. eLife. 6, 26652 (2017).
  12. Perez, M. F., Francesconi, M., Hidalgo-Carcedo, C., Lehner, B. Maternal age generates phenotypic variation in Caenorhabditis elegans. Nature. 552 (7683), 106-109 (2017).
  13. Baeriswyl, S., et al. Modulation of aging profiles in isogenic populations of Caenorhabditis elegans by bacteria causing different extrinsic mortality rates. Biogerontology. 11 (1), 53 (2009).
  14. Taylor, M., Vega, N. M. Host immunity alters community ecology and stability of the microbiome in a Caenorhabditis elegans model. mSystems. 6 (2), 00608-00620 (2021).
  15. Diaz, S. A., Restif, O. Spread and transmission of bacterial pathogens in experimental populations of the nematode Caenorhabditis elegans. Applied and Environmental Microbiology. 80 (17), 5411-5418 (2014).
  16. Twumasi-Boateng, K., Berg, M., Shapira, M. Automated separation of C. elegans variably colonized by a bacterial pathogen. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (85), e51090 (2014).
  17. Ortiz, A., Vega, N. M., Ratzke, C., Gore, J. Interspecies bacterial competition regulates community assembly in the C. elegans intestine. The ISME Journal. 15 (7), 2131-2145 (2021).
  18. Berg, M., et al. TGFβ/BMP immune signaling affects abundance and function of C. elegans gut commensals. Nature Communications. 10 (1), 604 (2019).
  19. Portal-Celhay, C., Blaser, M. J. Competition and resilience between founder and introduced bacteria in the Caenorhabditis elegans gut. Infection and Immunity. 80 (3), 1288-1299 (2012).
  20. Scott, E., Holden-Dye, L., O’Connor, V., Wand, M. E. Intra strain variation of the effects of gram-negative ESKAPE pathogens on intestinal colonization, host viability, and host response in the model organism Caenorhabditis elegans. Frontiers in Microbiology. 10, 3113 (2020).
  21. Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Genome Biology. 2 (1), (2001).
  22. Dirksen, P., et al. The native microbiome of the nematode Caenorhabditis elegans: gateway to a new host-microbiome model. BMC Biology. 14, 38 (2016).
  23. Vega, N. M., Allison, K. R., Samuels, A. N., Klempner, M. S., Collins, J. J. Salmonella typhimurium intercepts Escherichia coli signaling to enhance antibiotic tolerance. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (35), 14420-14425 (2013).
  24. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , (2006).
  25. Tabara, H., et al. The rde-1 gene, RNA interference, and transposon silencing in C. elegans. Cell. 99 (2), 123-132 (1999).
  26. Ahringer, J. Reverse genetics. WormBook. , (2006).
  27. Rual, J. -. F., et al. Toward improving Caenorhabditis elegans phenome mapping with an ORFeome-based RNAi library. Genome Research. 14 (10), 2162-2168 (2004).
  28. Revtovich, A. V., et al. Development and characterization of high-throughput Caenorhabditis elegans – Enterococcus faecium infection model. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 667327 (2021).
  29. Anderson, Q. L., Revtovich, A. V., Kirienko, N. V. A high-throughput, high-content, liquid-based C. elegans pathosystem. JoVE (Journal of Visualized Experiments. (137), e58068 (2018).
  30. Scholz, M., Dinner, A. R., Levine, E., Biron, D. Stochastic feeding dynamics arise from the need for information and energy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (35), 9261-9266 (2017).
  31. Wu, T., et al. Pheromones modulate learning by regulating the balanced signals of two insulin-like peptides. Neuron. 104 (6), 1095-1109 (2019).
  32. Ching, T. -. T., Hsu, A. -. L. Solid plate-based dietary restriction in Caenorhabditis elegans. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (51), e2701 (2011).
  33. Walker, A. C., Bhargava, R., Vaziriyan-Sani, A. S., Brust, A. S., Czyz, D. M. Quantification of bacterial loads in Caenorhabditis elegans. Bio-protocol. 12 (2), 4291-4291 (2022).
  34. Manjarrez, J. R., Mailler, R. Stress and timing associated with Caenorhabditis elegans immobilization methods. Heliyon. 6 (7), 04263 (2020).
  35. Zhang, S., Banerjee, D., Kuhn, J. R. Isolation and culture of larval cells from C. elegans. PLoS ONE. 6 (4), 0019505 (2011).
  36. Garsin, D. A., et al. Long-lived C. elegans daf-2 mutants are resistant to bacterial pathogens. Science. 300 (5627), 1921 (2003).
  37. Thutupalli, S., et al. Farming and public goods production in Caenorhabditis elegans populations. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (9), 2289-2294 (2017).
  38. Ly, K., Reid, S. J., Snell, R. G. Rapid RNA analysis of individual Caenorhabditis elegans. MethodsX. 2, 59-63 (2015).
  39. Johnke, J., Dirksen, P., Schulenburg, H. Community assembly of the native C. elegans microbiome is influenced by time, substrate, and individual bacterial taxa. Environmental Microbiology. 22 (4), 1265-1279 (2020).
  40. Vega, N. M., Gore, J. Stochastic assembly produces heterogeneous communities in the Caenorhabditis elegans intestine. PLOS Biology. 15 (3), 2000633 (2017).
  41. Gulyas, L., Powell, J. R. Cold shock induces a terminal investment reproductive response in C. elegans. Scientific Reports. 12 (1), 1338 (2022).
  42. Jiang, W., et al. A genetic program mediates cold-warming response and promotes stress-induced phenoptosis in C. elegans. eLife. 7, 35037 (2018).
  43. Robinson, J. D., Powell, J. R. Long-term recovery from acute cold shock in Caenorhabditis elegans. BMC Cell Biology. 17 (1), 2 (2016).

Tags

Keywords: Caenorhabditis ElegansBacterial InteractionsSingle-worm DataMechanical Disruption96-well FormatMedium ThroughputQuantificationWorm MeasurementsM9TX01OP50SDS/DTT SolutionChemical PermeabilizationWorm Cuticle
check_url/64027?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Taylor, M. N., Spandana Boddu, S., Vega, N. M. Using Single-Worm Data to Quantify Heterogeneity in Caenorhabditis elegans-Bacterial Interactions. J. Vis. Exp. (185), e64027, doi:10.3791/64027 (2022).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image