Caenorhabditis elegans-Bakteriyel Etkileşimlerde Heterojenliği Ölçmek için Tek Solucanlı Verileri Kullanma
Summary
Bu protokol, dış bakterileri uzaklaştırmak için soğuk felç ve yüzey ağartmayı takiben bireysel bakteriyel olarak kolonize Caenorhabditis elegans’ın 96 kuyucuklu bir bozulmasını tanımlar. Elde edilen süspansiyon, çok sayıda bireysel solucanda bakteri yükünün doğru, orta verimli bir şekilde ölçülmesini sağlamak için agar plakaları üzerine kaplanmıştır.
Abstract
Nematod Caenorhabditis elegans , konakçı-mikrop ve konakçı-mikrobiyom etkileşimleri için model bir sistemdir. Bugüne kadar yapılan birçok çalışma, bu organizmadaki bakteri yükünü ölçmek için bireysel solucan örnekleri yerine toplu sindirmeler kullanmaktadır. Burada, C. elegans bağırsağının bakteriyel kolonizasyonunda görülen bireyler arası büyük değişkenliğin bilgilendirici olduğu ve toplu sindirim yöntemlerinin, koşullar arasında doğru karşılaştırma için önemli olan bilgileri attığı iddia edilmektedir. Bu örneklere özgü varyasyonu tanımlamak çok sayıda birey gerektirdiğinden, bireysel solucanların bozulması ve koloni kaplaması için uygun bir 96 kuyucuklu plaka protokolü oluşturulmuştur.
Introduction
Konakçı-mikrop ilişkilerinde heterojenlik her yerde gözlenmektedir ve bireyler arasındaki varyasyon, rekabet ve birlikte yaşama1’den hastalık bulaşması 2,3,4’e kadar popülasyon düzeyindeki süreçlere katkıda bulunan bir faktör olarak giderek daha fazla kabul edilmektedir. C. elegans’ta, izojenik popülasyonlar içindeki “gizli heterojenlik” tekrar tekrar gözlemlenmiştir; bireylerin alt popülasyonları, ısı şoku yanıtı5,6, yaşlanma ve yaşam süresi 7,8,9,10,11 ve fizyoloji ve gelişimin diğer birçok yönü 12 . Alt popülasyon yapısını tanımlamaya çalışan analizlerin çoğu, izojenik, senkronize solucanların deneysel popülasyonlarındaki iki alt popülasyon için kanıt sağlar 5,7,8, ancak diğer veriler farklı gruplardan ziyade özelliklerin popülasyon içi dağılımlarının olasılığını göstermektedir 7,12,13 . Burada önemli olan, bağırsak popülasyonlarında önemli bir heterojenlik, paylaşılan bir mikrop kaynağından 13,14,15,16 kolonize edilen solucanların izojenik popülasyonlarında bile gözlenir ve bu heterojenlik, solucanda bakteri niceliği için yaygın olarak kullanılan 17,18,19,20 parti sindirim ölçümleri ile gizlenebilir.
Bu çalışma, konakçı-mikrop ilişkisinde tek solucan ölçümlerine daha fazla güvenmenin yanı sıra tek solucan bozulmasında doğruluğu ve verimi artırmak için protokollere daha fazla güvenme ihtiyacını gösteren veriler sunmaktadır. Bu protokoller, canlı bakteri yükünün nicelleştirilmesi için çok sayıda bireysel C. elegan’ın mekanik olarak bozulmasını kolaylaştırmak için tasarlanmıştır, aynı zamanda bireysel solucanların havaneli bazlı bozulmasından daha iyi tekrarlanabilirlik ve numune başına daha az çaba sağlar. Solucanların, bozulmaya hazırlanmadan önce ısıl olarak öldürülen E. coli ile beslenmelerine izin verilen önerilen bir bağırsak temizleme adımı, yakın zamanda yutulan ve diğer geçici (yapışmamış) bakterilerin katkılarını en aza indirmek için dahil edilmiştir. Bu protokoller, kütikülün düşük konsantrasyonlu bir yüzey ağartıcı işlemi ile temizlenmesi için soğuk felç yöntemini içerir; yüzey ağartma, tek solucanlı bozulmada bir hazırlık adımı olarak veya canlı, harici olarak mikropsuz solucanlar hazırlamak için bir yöntem olarak kullanılabilir. Bu yüzey ağartma yöntemi, çok çeşitli dış mikropları uzaklaştırmak için yeterlidir ve soğuk işlem, geleneksel levamisol bazlı felce bir alternatif sağlar; Soğuğa duyarlı deneyler için levamisol tercih edilirken, soğuk felç tehlikeli atık akışlarına katkıları en aza indirir ve normal aktivitenin hızlı bir şekilde yeniden başlatılmasını sağlar. Tam protokol, solucanların bilinen bakterilerle kolonize edildiği bir laboratuvar deneyini tanımlarken, solucanları temizleme prosedürleri ve tek solucan bozulması, vahşi örneklerden izole edilen veya mikrokozmos deneylerinde kolonize edilen solucanlara kolayca uygulanabilir. Burada açıklanan protokoller, solucan bağırsağından ekstrakte edilen, bireysel solucanlarda koloni oluşturan birimlerin (CFU’lar) kaplanması ve nicelleştirilmesi için uygun canlı bakteriler üretir; Dizileme tabanlı bağırsak topluluğu analizi için, sonraki hücre lizisi ve nükleik asit ekstraksiyon adımları bu protokollere eklenmelidir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada, C. elegans’taki bakteri yükünün tek solucanlı nicelleştirilmesinin avantajları ve bu tür büyük veri kümelerinin hızlı ve tutarlı bir şekilde elde edilmesini sağlamak için 96 kuyucuklu bir bozulma protokolü hakkında veriler sunulmaktadır. Mevcut yöntemlerle karşılaştırıldığında33, bu protokoller solucandaki bağırsak mikrobiyal topluluklarının daha yüksek verimli ölçümüne izin verir.
Bu yaklaşım, hız sınırlayıcı…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, H. Schulenberg ve C. LaRock’a bu deneylerde kullanılan bakteri suşlarının cömert paylaşımları için teşekkür etmek istiyorlar. Bu çalışma Emory Üniversitesi ve NSF’nin (PHY2014173) finansmanıyla desteklenmiştir.
Materials
| 96-well flat-bottom polypropylene plates, 300 uL | Evergreen Labware | 290-8350-03F | |
| 96-well plate sealing mat, silicon, square wells (AxyMat) | Axygen | AM-2ML-SQ | |
| 96-well plates, 2 mL, square wells | Axygen | P-2ML-SQ-C-S | |
| 96-well polypropylene plate lids | Evergreen Labware | 290-8020-03L | |
| Agar | Fisher Scientific | 443570050 | |
| Bead mill adapter set for 96-well plates | QIAGEN | 119900 | Adapter plates for use with two 96-well plates on the TissueLyser II |
| Bead mill tissue homogenizer (TissueLyser II) | QIAGEN | 85300 | Mechanical homogenizer for medium to high-throughput sample disruption |
| BioSorter | Union Biometrica | By quotation | Large object sorter equipped with a 250 micron focus for C. elegans |
| Bleach, commercial, 8.25% sodium hypochlorite | Clorox | ||
| Breathe-Easy 96-well gas permeable sealing membrane | Diversified Biotech | BEM-1 | Multiwell plate gas permeable polyurethane membranes. Thin sealing film is permeable to O2, CO2, and water vapors and is UV transparent down to 300 nm. Sterile, 100/box. |
| Calcium chloride dihydrate | Fisher Scientific | AC423525000 | |
| Cholesterol | VWR | AAA11470-30 | |
| Citric acid monohydrate | Fisher Scientific | AC124910010 | |
| Copper (II) sulfate pentahydrate | Fisher Scientific | AC197722500 | |
| Corning 6765 LSE Mini Microcentrifuge | Corning | COR-6765 | |
| Disodium EDTA | Fisher Scientific | 409971000 | |
| DL 1,4 Dithiothreitol, 99+%, for mol biology, DNAse, RNAse and Protease free, ACROS Organics | Fisher Scientific | 327190010 | |
| Eppendorf 1.5 mL microcentrifuge tubes, natural | Eppendorf | ||
| Eppendorf 5424R microcentrifuge | Eppendorf | 5406000640 | 24-place refrigerated benchtop microcentrifuge |
| Eppendorf 5810R centrifuge with rotor S-4-104 | Eppendorf | 22627040 | 3L benchtop centrifuge with adaptors for 15-50 mL tubes and plates |
| Eppendorf plate bucket (x2), for Rotor S-4-104 | Eppendorf | 22638930 | |
| Ethanol 100% | Fisher Scientific | BP2818500 | |
| Glass beads, 2.7 mm | Life Science Products | LS-79127 | |
| Glass beads, acid-washed, 425-600 µm | Sigma | G877-500G | |
| Glass plating beads | VWR | 76005-124 | |
| Hydrochloric acid | VWR | BDH7204-1 | |
| Iron (II) sulfate heptahydrate | Fisher Scientific | 423731000 | |
| Kimble Kontes pellet pestle motor | DWK Life Sciences | 749540-0000 | |
| Kimble Kontes polypropylene pellet pestles and microtubes, 0.5 mL | DWK Life Sciences | 749520-0590 | |
| Leica DMi8 motorized inverted microscope with motorized stage | Leica | 11889113 | |
| Leica LAS X Premium software | Leica | 11640687 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Fisher Scientific | AC124900010 | |
| Manganese(II) chloride tetrahydrate | VWR | 470301-706 | |
| PARAFILM M flexible laboratory sealing film | Amcor | PM996 | |
| Peptone | Fisher Scientific | BP1420-500 | |
| Petri dishes, round, 10 cm | VWR | 25384-094 | |
| Petri dishes, round, 6 cm | VWR | 25384-092 | |
| Petri dishes, square, 10 x 10 cm | VWR | 10799-140 | |
| Phospho-buffered saline (1X PBS) | Gold Bio | P-271-200 | |
| Polypropylene autoclave tray, shallow | Fisher Scientific | 13-361-10 | |
| Potassium hydroxide | Fisher Scientific | AC134062500 | |
| Potassium phosphate dibasic | Fisher Scientific | BP363-1 | |
| Potassium phosphate monobasic | Fisher Scientific | BP362-1 | |
| R 4.1.3/RStudio 2022.02.0 build 443 | R Foundation | n/a | |
| Scoop-type laboratory spatula, metal | VWR | 470149-438 | |
| Silicon carbide 36 grit | MJR Tumblers | n/a | Black extra coarse silicon carbide grit. Available in 0.5-5 lb sizes from this vendor. |
| Sodium dodecyl sulfate | Fisher Scientific | BP166-100 | |
| Sodium hydroxide | VWR | BDH7247-1 | |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous | Fisher Scientific | BP332-500 | |
| Sodum chloride | Fisher Scientific | BP358-1 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | AC419760010 | |
| Tri-potassium citrate monohydrate | Fisher Scientific | AC611755000 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 | |
| Zinc sulfate heptahydrate | Fisher Scientific | AC205982500 |
References
- Armitage, D. W., Jones, S. E. How sample heterogeneity can obscure the signal of microbial interactions. The ISME Journal. 13 (11), 2639-2646 (2019).
- Stephenson, J., et al. Host heterogeneity affects both parasite transmission to and fitness on subsequent hosts. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 372 (1719), 20160093 (2017).
- VanderWaal, K. L., Ezenwa, V. O. Heterogeneity in pathogen transmission: mechanisms and methodology. Functional Ecology. 30 (10), 1606-1622 (2016).
- Dwyer, G., Elkinton, J. S., Buonaccorsi, J. P. Host heterogeneity in susceptibility and disease dynamics: tests of a mathematical model. The American Naturalist. 150 (6), 685-707 (1997).
- Wu, D., Rea, S. L., Yashin, A. I., Johnson, T. E. Visualizing hidden heterogeneity in isogenic populations of C. elegans. Experimental Gerontology. 41 (3), 261-270 (2006).
- Yashin, A. I., et al. Heat shock changes the heterogeneity distribution in populations of Caenorhabditis elegans does it tell us anything about the biological mechanism of stress response. The Journals of Gerontology Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 57 (3), 83-92 (2002).
- Zhao, Y., et al. Two forms of death in ageing Caenorhabditis elegans. Nature Communications. 8 (1), 1-8 (2017).
- Eckley, D. M., et al. Molecular characterization of the transition to mid-life in Caenorhabditis elegans. AGE. 35 (3), 689-703 (2012).
- Rea, S. L., Wu, D., Cypser, J. R., Vaupel, J. W., Johnson, T. E. A stress-sensitive reporter predicts longevity in isogenic populations of Caenorhabditis elegans. Nature Genetics. 37 (8), 894-898 (2005).
- Kinser, H. E., Mosley, M. C., Plutzer, I. B., Pincus, Z. Global, cell non-autonomous gene regulation drives individual lifespan among isogenic C. elegans. eLife. , (2021).
- Churgin, M. A., et al. Longitudinal imaging of Caenorhabditis elegans in a microfabricated device reveals variation in behavioral decline during aging. eLife. 6, 26652 (2017).
- Perez, M. F., Francesconi, M., Hidalgo-Carcedo, C., Lehner, B. Maternal age generates phenotypic variation in Caenorhabditis elegans. Nature. 552 (7683), 106-109 (2017).
- Baeriswyl, S., et al. Modulation of aging profiles in isogenic populations of Caenorhabditis elegans by bacteria causing different extrinsic mortality rates. Biogerontology. 11 (1), 53 (2009).
- Taylor, M., Vega, N. M. Host immunity alters community ecology and stability of the microbiome in a Caenorhabditis elegans model. mSystems. 6 (2), 00608-00620 (2021).
- Diaz, S. A., Restif, O. Spread and transmission of bacterial pathogens in experimental populations of the nematode Caenorhabditis elegans. Applied and Environmental Microbiology. 80 (17), 5411-5418 (2014).
- Twumasi-Boateng, K., Berg, M., Shapira, M. Automated separation of C. elegans variably colonized by a bacterial pathogen. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (85), e51090 (2014).
- Ortiz, A., Vega, N. M., Ratzke, C., Gore, J. Interspecies bacterial competition regulates community assembly in the C. elegans intestine. The ISME Journal. 15 (7), 2131-2145 (2021).
- Berg, M., et al. TGFβ/BMP immune signaling affects abundance and function of C. elegans gut commensals. Nature Communications. 10 (1), 604 (2019).
- Portal-Celhay, C., Blaser, M. J. Competition and resilience between founder and introduced bacteria in the Caenorhabditis elegans gut. Infection and Immunity. 80 (3), 1288-1299 (2012).
- Scott, E., Holden-Dye, L., O’Connor, V., Wand, M. E. Intra strain variation of the effects of gram-negative ESKAPE pathogens on intestinal colonization, host viability, and host response in the model organism Caenorhabditis elegans. Frontiers in Microbiology. 10, 3113 (2020).
- Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Genome Biology. 2 (1), (2001).
- Dirksen, P., et al. The native microbiome of the nematode Caenorhabditis elegans: gateway to a new host-microbiome model. BMC Biology. 14, 38 (2016).
- Vega, N. M., Allison, K. R., Samuels, A. N., Klempner, M. S., Collins, J. J. Salmonella typhimurium intercepts Escherichia coli signaling to enhance antibiotic tolerance. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (35), 14420-14425 (2013).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , (2006).
- Tabara, H., et al. The rde-1 gene, RNA interference, and transposon silencing in C. elegans. Cell. 99 (2), 123-132 (1999).
- Ahringer, J. Reverse genetics. WormBook. , (2006).
- Rual, J. -. F., et al. Toward improving Caenorhabditis elegans phenome mapping with an ORFeome-based RNAi library. Genome Research. 14 (10), 2162-2168 (2004).
- Revtovich, A. V., et al. Development and characterization of high-throughput Caenorhabditis elegans – Enterococcus faecium infection model. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 667327 (2021).
- Anderson, Q. L., Revtovich, A. V., Kirienko, N. V. A high-throughput, high-content, liquid-based C. elegans pathosystem. JoVE (Journal of Visualized Experiments. (137), e58068 (2018).
- Scholz, M., Dinner, A. R., Levine, E., Biron, D. Stochastic feeding dynamics arise from the need for information and energy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (35), 9261-9266 (2017).
- Wu, T., et al. Pheromones modulate learning by regulating the balanced signals of two insulin-like peptides. Neuron. 104 (6), 1095-1109 (2019).
- Ching, T. -. T., Hsu, A. -. L. Solid plate-based dietary restriction in Caenorhabditis elegans. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (51), e2701 (2011).
- Walker, A. C., Bhargava, R., Vaziriyan-Sani, A. S., Brust, A. S., Czyz, D. M. Quantification of bacterial loads in Caenorhabditis elegans. Bio-protocol. 12 (2), 4291-4291 (2022).
- Manjarrez, J. R., Mailler, R. Stress and timing associated with Caenorhabditis elegans immobilization methods. Heliyon. 6 (7), 04263 (2020).
- Zhang, S., Banerjee, D., Kuhn, J. R. Isolation and culture of larval cells from C. elegans. PLoS ONE. 6 (4), 0019505 (2011).
- Garsin, D. A., et al. Long-lived C. elegans daf-2 mutants are resistant to bacterial pathogens. Science. 300 (5627), 1921 (2003).
- Thutupalli, S., et al. Farming and public goods production in Caenorhabditis elegans populations. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (9), 2289-2294 (2017).
- Ly, K., Reid, S. J., Snell, R. G. Rapid RNA analysis of individual Caenorhabditis elegans. MethodsX. 2, 59-63 (2015).
- Johnke, J., Dirksen, P., Schulenburg, H. Community assembly of the native C. elegans microbiome is influenced by time, substrate, and individual bacterial taxa. Environmental Microbiology. 22 (4), 1265-1279 (2020).
- Vega, N. M., Gore, J. Stochastic assembly produces heterogeneous communities in the Caenorhabditis elegans intestine. PLOS Biology. 15 (3), 2000633 (2017).
- Gulyas, L., Powell, J. R. Cold shock induces a terminal investment reproductive response in C. elegans. Scientific Reports. 12 (1), 1338 (2022).
- Jiang, W., et al. A genetic program mediates cold-warming response and promotes stress-induced phenoptosis in C. elegans. eLife. 7, 35037 (2018).
- Robinson, J. D., Powell, J. R. Long-term recovery from acute cold shock in Caenorhabditis elegans. BMC Cell Biology. 17 (1), 2 (2016).
