Usando dados de verme único para quantificar a heterogeneidade em Interações elegans-bacterianas de Caenorhabditis
Summary
Este protocolo descreve uma interrupção de 96 poços de caenorhabditis colonizada individualmente elegans após paralisia fria e branqueamento superficial para remover bactérias externas. A suspensão resultante é emplacada em placas de ágar para permitir quantificação precisa e média de carga bacteriana em um grande número de vermes individuais.
Abstract
O nematode Caenorhabditis elegans é um sistema modelo para interações hospedeiro-micróbio e hospedeiro-microbioma. Muitos estudos até o momento usam digerir em lote em vez de amostras individuais de vermes para quantificar a carga bacteriana neste organismo. Argumenta-se aqui que a grande variabilidade inter-individual observada na colonização bacteriana do intestino C. elegans é informativa, e que os métodos de digestão em lote descartam informações que são importantes para uma comparação precisa entre as condições. Como descrever a variação inerente a essas amostras requer um grande número de indivíduos, um conveniente protocolo de placa de 96 poços para interrupção e revestimento de colônia de vermes individuais é estabelecido.
Introduction
A heterogeneidade nas associações hospedeiras-micróbios é observada de forma onipresente, e a variação entre os indivíduos é cada vez mais reconhecida como fator contribuinte nos processos de nível populacional desde a concorrência e a convivência1 até a transmissão da doença 2,3,4. Em C. elegans, a “heterogeneidade oculta” dentro das populações isogênicas tem sido observada repetidamente, com sub-populações de indivíduos apresentando fenótipos distintos na resposta ao choque térmico 5,6, envelhecimento e vida útil 7,8,9,10,11, e muitos outros aspectos da fisiologia e desenvolvimento12 . A maioria das análises que tentam identificar a estrutura sub-populacional fornecem evidências para duas subsédias em populações experimentais de vermes isogênicos e sincronizados 5,7,8, embora outros dados sugiram a possibilidade de distribuições dentro da população de traços em vez de grupos distintos 7,12,13 . De relevância aqui, observa-se uma heterogeneidade substancial nas populações intestinais mesmo dentro de populações isogênicas de vermes colonizados a partir de uma fonte compartilhada de micróbios 13,14,15,16, e essa heterogeneidade pode ser ocultada pelas medições de digestão em lote que são amplamente utilizadas 17,18,19,20 para quantificação bacteriana no verme.
Este trabalho apresenta dados que sugerem uma necessidade de maior dependência de medições de um único verme na associação hospedeiro-micróbio, bem como protocolos para aumentar a precisão e o throughput na interrupção de um único worm. Estes protocolos são projetados para facilitar a interrupção mecânica de um grande número de C. elegans individuais para quantificação de carga bacteriana viável, ao mesmo tempo em que fornecem melhor repetibilidade e menor esforço por amostra do que a interrupção baseada em pilão de vermes individuais. Uma etapa recomendada de purificação intestinal, onde os vermes são autorizados a se alimentar de E. coli morto pelo calor antes da preparação para a interrupção, está incluído para minimizar contribuições de bactérias recém-ingeridas e outras bactérias transitórias (não aderidas). Estes protocolos incluem um método de paralisia fria para limpar a cutícula com um tratamento de alvejante superficial de baixa concentração; o branqueamento da superfície pode ser usado como um passo preparatório na interrupção de um único verme ou como um método para preparar vermes vivos e externamente livres de germes. Este método de branqueamento superficial é suficiente para remover uma ampla gama de micróbios externos, e o tratamento a frio fornece uma alternativa à paralisia convencional à base de levamisola; Enquanto o levamisole será preferido para experimentos sensíveis ao frio, a paralisia fria minimiza as contribuições para fluxos de resíduos perigosos e permite a rápida retomada da atividade normal. Enquanto o protocolo completo descreve um experimento de laboratório onde os vermes são colonizados com bactérias conhecidas, os procedimentos para limpar vermes e interrupção de um único verme podem ser facilmente aplicados a vermes isolados de amostras selvagens ou colonizados em experimentos de microcosmo. Os protocolos descritos aqui produzem bactérias vivas extraídas do intestino de verme, adequadas para chapeamento e quantificação de unidades formadoras de colônias (UFC) em vermes individuais; para análise da comunidade intestinal baseada em sequenciamento, devem ser adicionadas etapas subsequentes de lise celular e extração de ácido nucleico a esses protocolos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aqui os dados são apresentados sobre as vantagens da quantificação de um único verme da carga bacteriana em C. elegans, juntamente com um protocolo de interrupção de 96 poços para permitir a rápida e consistente aquisição de grandes conjuntos de dados deste tipo. Em comparação com os métodos existentes33, esses protocolos permitem uma medição de maior rendimento das comunidades microbianas intestinais no verme.
Essa abordagem tem o revestimento c…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostariam de reconhecer H. Schulenberg e C. LaRock por seu generoso compartilhamento de cepas bacterianas usadas nesses experimentos. Este trabalho foi apoiado por financiamento da Universidade Emory e da NSF (PHY2014173).
Materials
| 96-well flat-bottom polypropylene plates, 300 uL | Evergreen Labware | 290-8350-03F | |
| 96-well plate sealing mat, silicon, square wells (AxyMat) | Axygen | AM-2ML-SQ | |
| 96-well plates, 2 mL, square wells | Axygen | P-2ML-SQ-C-S | |
| 96-well polypropylene plate lids | Evergreen Labware | 290-8020-03L | |
| Agar | Fisher Scientific | 443570050 | |
| Bead mill adapter set for 96-well plates | QIAGEN | 119900 | Adapter plates for use with two 96-well plates on the TissueLyser II |
| Bead mill tissue homogenizer (TissueLyser II) | QIAGEN | 85300 | Mechanical homogenizer for medium to high-throughput sample disruption |
| BioSorter | Union Biometrica | By quotation | Large object sorter equipped with a 250 micron focus for C. elegans |
| Bleach, commercial, 8.25% sodium hypochlorite | Clorox | ||
| Breathe-Easy 96-well gas permeable sealing membrane | Diversified Biotech | BEM-1 | Multiwell plate gas permeable polyurethane membranes. Thin sealing film is permeable to O2, CO2, and water vapors and is UV transparent down to 300 nm. Sterile, 100/box. |
| Calcium chloride dihydrate | Fisher Scientific | AC423525000 | |
| Cholesterol | VWR | AAA11470-30 | |
| Citric acid monohydrate | Fisher Scientific | AC124910010 | |
| Copper (II) sulfate pentahydrate | Fisher Scientific | AC197722500 | |
| Corning 6765 LSE Mini Microcentrifuge | Corning | COR-6765 | |
| Disodium EDTA | Fisher Scientific | 409971000 | |
| DL 1,4 Dithiothreitol, 99+%, for mol biology, DNAse, RNAse and Protease free, ACROS Organics | Fisher Scientific | 327190010 | |
| Eppendorf 1.5 mL microcentrifuge tubes, natural | Eppendorf | ||
| Eppendorf 5424R microcentrifuge | Eppendorf | 5406000640 | 24-place refrigerated benchtop microcentrifuge |
| Eppendorf 5810R centrifuge with rotor S-4-104 | Eppendorf | 22627040 | 3L benchtop centrifuge with adaptors for 15-50 mL tubes and plates |
| Eppendorf plate bucket (x2), for Rotor S-4-104 | Eppendorf | 22638930 | |
| Ethanol 100% | Fisher Scientific | BP2818500 | |
| Glass beads, 2.7 mm | Life Science Products | LS-79127 | |
| Glass beads, acid-washed, 425-600 µm | Sigma | G877-500G | |
| Glass plating beads | VWR | 76005-124 | |
| Hydrochloric acid | VWR | BDH7204-1 | |
| Iron (II) sulfate heptahydrate | Fisher Scientific | 423731000 | |
| Kimble Kontes pellet pestle motor | DWK Life Sciences | 749540-0000 | |
| Kimble Kontes polypropylene pellet pestles and microtubes, 0.5 mL | DWK Life Sciences | 749520-0590 | |
| Leica DMi8 motorized inverted microscope with motorized stage | Leica | 11889113 | |
| Leica LAS X Premium software | Leica | 11640687 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Fisher Scientific | AC124900010 | |
| Manganese(II) chloride tetrahydrate | VWR | 470301-706 | |
| PARAFILM M flexible laboratory sealing film | Amcor | PM996 | |
| Peptone | Fisher Scientific | BP1420-500 | |
| Petri dishes, round, 10 cm | VWR | 25384-094 | |
| Petri dishes, round, 6 cm | VWR | 25384-092 | |
| Petri dishes, square, 10 x 10 cm | VWR | 10799-140 | |
| Phospho-buffered saline (1X PBS) | Gold Bio | P-271-200 | |
| Polypropylene autoclave tray, shallow | Fisher Scientific | 13-361-10 | |
| Potassium hydroxide | Fisher Scientific | AC134062500 | |
| Potassium phosphate dibasic | Fisher Scientific | BP363-1 | |
| Potassium phosphate monobasic | Fisher Scientific | BP362-1 | |
| R 4.1.3/RStudio 2022.02.0 build 443 | R Foundation | n/a | |
| Scoop-type laboratory spatula, metal | VWR | 470149-438 | |
| Silicon carbide 36 grit | MJR Tumblers | n/a | Black extra coarse silicon carbide grit. Available in 0.5-5 lb sizes from this vendor. |
| Sodium dodecyl sulfate | Fisher Scientific | BP166-100 | |
| Sodium hydroxide | VWR | BDH7247-1 | |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous | Fisher Scientific | BP332-500 | |
| Sodum chloride | Fisher Scientific | BP358-1 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | AC419760010 | |
| Tri-potassium citrate monohydrate | Fisher Scientific | AC611755000 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 | |
| Zinc sulfate heptahydrate | Fisher Scientific | AC205982500 |
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