Этот протокол описывает 96-луночное нарушение отдельных бактериально колонизированных Caenorhabditis elegans после холодного паралича и поверхностного обесцвечивания для удаления внешних бактерий. Полученная суспензия наносится на агаровые пластины, чтобы обеспечить точную, среднепроизводительную количественную количественную оценку бактериальной нагрузки у большого количества отдельных червей.
Нематода Caenorhabditis elegans является модельной системой для взаимодействия хозяин-микроб и хозяин-микробиом. Многие исследования на сегодняшний день используют периодические дайджесты, а не отдельные образцы червей для количественной оценки бактериальной нагрузки в этом организме. Здесь утверждается, что большая межиндивидуальная изменчивость, наблюдаемая при бактериальной колонизации кишечника C. elegans , является информативной, и что методы периодического переваривания отбрасывают информацию, которая важна для точного сравнения между условиями. Поскольку описание вариаций, присущих этим образцам, требует большого количества особей, установлен удобный протокол плиты из 96 скважин для разрушения и покрытия колоний отдельных червей.
Гетерогенность в ассоциациях хозяин-микроб наблюдается повсеместно, и различия между индивидуумами все чаще признаются в качестве фактора, способствующего процессам на уровне популяции от конкуренции и сосуществования1 до передачи болезни 2,3,4. У C. elegans «скрытая гетерогенность» в изогенных популяциях наблюдалась неоднократно, причем субпопуляции особей демонстрировали различные фенотипы в реакции теплового шока 5,6, старении и продолжительности жизни 7,8,9,10,11 и многих других аспектах физиологии и развития12. . Большинство анализов, которые пытаются идентифицировать субпопуляционную структуру, дают доказательства для двух субпопуляций в экспериментальных популяциях изогенных, синхронизированных червей 5,7,8, хотя другие данные предполагают возможность внутрипопуляционного распределения признаков, а не отдельных групп 7,12,13 . Здесь уместно отметить, что существенная гетерогенность в кишечных популяциях наблюдается даже в пределах изогенных популяций червей, колонизированных из общего источника микробов 13,14,15,16, и эта неоднородность может быть скрыта измерениями периодического переваривания, которые широко используются 17,18,19,20 для количественной оценки бактерий у червя.
В этой работе представлены данные, свидетельствующие о необходимости большей зависимости от измерений одного червя в ассоциации между хозяином и микробом, а также протоколов для повышения точности и пропускной способности при нарушении работы одного червя. Эти протоколы предназначены для облегчения механического разрушения большого количества отдельных C. elegans для количественной оценки жизнеспособной бактериальной нагрузки, обеспечивая при этом лучшую повторяемость и более низкое усилие на образец, чем разрушение отдельных червей на основе пестика. Рекомендуемый этап очистки кишечника, на котором червям разрешается питаться убитой теплом кишечной палочкой до подготовки к нарушению, включен для минимизации вклада недавно проглоченных и других переходных (неприлипших) бактерий. Эти протоколы включают метод холодного паралича для очистки кутикулы с низкоконцентрированной поверхностной отбеливающей обработкой; Поверхностное отбеливание может быть использовано в качестве подготовительного этапа при разрушении одиночных червей или в качестве метода подготовки живых, внешне свободных от микробов червей. Этот метод поверхностного отбеливания достаточен для удаления широкого спектра внешних микробов, а холодная обработка обеспечивает альтернативу обычному параличу на основе левамизола; в то время как левамизол будет предпочтительным для экспериментов, чувствительных к холоду, холодный паралич сводит к минимуму вклад в потоки опасных отходов и позволяет быстро возобновить нормальную деятельность. В то время как полный протокол описывает лабораторный эксперимент, в котором черви колонизируются известными бактериями, процедуры очистки червей и разрушения одного червя могут быть легко применены к червям, выделенным из диких образцов или колонизированным в экспериментах с микромиром. Протоколы, описанные здесь, производят живые бактерии, извлеченные из кишечника червя, пригодные для покрытия и количественной оценки колониеобразующих единиц (КОЕ) у отдельных червей; для анализа кишечного сообщества на основе секвенирования к этим протоколам следует добавить последующие этапы лизиса клеток и экстракции нуклеиновых кислот.
Здесь представлены данные о преимуществах количественной оценки бактериальной нагрузки у C. elegans одним червем, а также протокола разрушения 96 скважин, позволяющего быстро и последовательно получать большие наборы данных этого типа. По сравнению с существующими методами3…
The authors have nothing to disclose.
Авторы хотели бы поблагодарить Х. Шуленберга и К. ЛаРока за их щедрое совместное использование бактериальных штаммов, используемых в этих экспериментах. Эта работа была поддержана финансированием Университета Эмори и NSF (PHY2014173).
96-well flat-bottom polypropylene plates, 300 uL | Evergreen Labware | 290-8350-03F | |
96-well plate sealing mat, silicon, square wells (AxyMat) | Axygen | AM-2ML-SQ | |
96-well plates, 2 mL, square wells | Axygen | P-2ML-SQ-C-S | |
96-well polypropylene plate lids | Evergreen Labware | 290-8020-03L | |
Agar | Fisher Scientific | 443570050 | |
Bead mill adapter set for 96-well plates | QIAGEN | 119900 | Adapter plates for use with two 96-well plates on the TissueLyser II |
Bead mill tissue homogenizer (TissueLyser II) | QIAGEN | 85300 | Mechanical homogenizer for medium to high-throughput sample disruption |
BioSorter | Union Biometrica | By quotation | Large object sorter equipped with a 250 micron focus for C. elegans |
Bleach, commercial, 8.25% sodium hypochlorite | Clorox | ||
Breathe-Easy 96-well gas permeable sealing membrane | Diversified Biotech | BEM-1 | Multiwell plate gas permeable polyurethane membranes. Thin sealing film is permeable to O2, CO2, and water vapors and is UV transparent down to 300 nm. Sterile, 100/box. |
Calcium chloride dihydrate | Fisher Scientific | AC423525000 | |
Cholesterol | VWR | AAA11470-30 | |
Citric acid monohydrate | Fisher Scientific | AC124910010 | |
Copper (II) sulfate pentahydrate | Fisher Scientific | AC197722500 | |
Corning 6765 LSE Mini Microcentrifuge | Corning | COR-6765 | |
Disodium EDTA | Fisher Scientific | 409971000 | |
DL 1,4 Dithiothreitol, 99+%, for mol biology, DNAse, RNAse and Protease free, ACROS Organics | Fisher Scientific | 327190010 | |
Eppendorf 1.5 mL microcentrifuge tubes, natural | Eppendorf | ||
Eppendorf 5424R microcentrifuge | Eppendorf | 5406000640 | 24-place refrigerated benchtop microcentrifuge |
Eppendorf 5810R centrifuge with rotor S-4-104 | Eppendorf | 22627040 | 3L benchtop centrifuge with adaptors for 15-50 mL tubes and plates |
Eppendorf plate bucket (x2), for Rotor S-4-104 | Eppendorf | 22638930 | |
Ethanol 100% | Fisher Scientific | BP2818500 | |
Glass beads, 2.7 mm | Life Science Products | LS-79127 | |
Glass beads, acid-washed, 425-600 µm | Sigma | G877-500G | |
Glass plating beads | VWR | 76005-124 | |
Hydrochloric acid | VWR | BDH7204-1 | |
Iron (II) sulfate heptahydrate | Fisher Scientific | 423731000 | |
Kimble Kontes pellet pestle motor | DWK Life Sciences | 749540-0000 | |
Kimble Kontes polypropylene pellet pestles and microtubes, 0.5 mL | DWK Life Sciences | 749520-0590 | |
Leica DMi8 motorized inverted microscope with motorized stage | Leica | 11889113 | |
Leica LAS X Premium software | Leica | 11640687 | |
Magnesium sulfate heptahydrate | Fisher Scientific | AC124900010 | |
Manganese(II) chloride tetrahydrate | VWR | 470301-706 | |
PARAFILM M flexible laboratory sealing film | Amcor | PM996 | |
Peptone | Fisher Scientific | BP1420-500 | |
Petri dishes, round, 10 cm | VWR | 25384-094 | |
Petri dishes, round, 6 cm | VWR | 25384-092 | |
Petri dishes, square, 10 x 10 cm | VWR | 10799-140 | |
Phospho-buffered saline (1X PBS) | Gold Bio | P-271-200 | |
Polypropylene autoclave tray, shallow | Fisher Scientific | 13-361-10 | |
Potassium hydroxide | Fisher Scientific | AC134062500 | |
Potassium phosphate dibasic | Fisher Scientific | BP363-1 | |
Potassium phosphate monobasic | Fisher Scientific | BP362-1 | |
R 4.1.3/RStudio 2022.02.0 build 443 | R Foundation | n/a | |
Scoop-type laboratory spatula, metal | VWR | 470149-438 | |
Silicon carbide 36 grit | MJR Tumblers | n/a | Black extra coarse silicon carbide grit. Available in 0.5-5 lb sizes from this vendor. |
Sodium dodecyl sulfate | Fisher Scientific | BP166-100 | |
Sodium hydroxide | VWR | BDH7247-1 | |
Sodium phosphate dibasic anhydrous | Fisher Scientific | BP332-500 | |
Sodum chloride | Fisher Scientific | BP358-1 | |
Sucrose | Fisher Scientific | AC419760010 | |
Tri-potassium citrate monohydrate | Fisher Scientific | AC611755000 | |
Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 | |
Zinc sulfate heptahydrate | Fisher Scientific | AC205982500 |