Uso de datos de un solo gusano para cuantificar la heterogeneidad en las interacciones caenorhabditis elegans-bacterianas
Summary
Este protocolo describe una interrupción de 96 pocillos de Caenorhabditis elegans colonizada bacterianamente después de la parálisis por frío y el blanqueamiento de la superficie para eliminar las bacterias externas. La suspensión resultante está chapada en placas de agar para permitir una cuantificación precisa y de rendimiento medio de la carga bacteriana en un gran número de gusanos individuales.
Abstract
El nematodo Caenorhabditis elegans es un sistema modelo para las interacciones huésped-microbioma y huésped-microbioma. Muchos estudios hasta la fecha utilizan resúmenes por lotes en lugar de muestras individuales de gusanos para cuantificar la carga bacteriana en este organismo. Aquí se argumenta que la gran variabilidad interindividual observada en la colonización bacteriana del intestino de C. elegans es informativa, y que los métodos de digestión por lotes descartan información que es importante para una comparación precisa entre las condiciones. Como la descripción de la variación inherente a estas muestras requiere un gran número de individuos, se establece un conveniente protocolo de placa de 96 pocillos para la interrupción y el recubrimiento de colonias de gusanos individuales.
Introduction
La heterogeneidad en las asociaciones huésped-microbio se observa de manera ubicua, y la variación entre individuos se reconoce cada vez más como un factor contribuyente en los procesos a nivel poblacional desde la competencia y la coexistencia1 hasta la transmisión de enfermedades 2,3,4. En C. elegans, se ha observado repetidamente “heterogeneidad oculta” dentro de las poblaciones isogénicas, con subpoblaciones de individuos que muestran fenotipos distintos en la respuesta al choque térmico 5,6, el envejecimiento y la esperanza de vida 7,8,9,10,11, y muchos otros aspectos de la fisiología y el desarrollo 12 . La mayoría de los análisis que intentan identificar la estructura de la subpoblación proporcionan evidencia de dos subpoblaciones en poblaciones experimentales de gusanos isogénicos y sincronizados 5,7,8, aunque otros datos sugieren la posibilidad de distribuciones de rasgos dentro de la población en lugar de grupos distintos 7,12,13 . De relevancia aquí, se observa una heterogeneidad sustancial en las poblaciones intestinales incluso dentro de las poblaciones isogénicas de gusanos colonizados a partir de una fuente compartida de microbios 13,14,15,16, y esta heterogeneidad puede ocultarse mediante las mediciones de digestión por lotes que se utilizan ampliamente 17,18,19,20 para la cuantificación bacteriana en el gusano.
Este trabajo presenta datos que sugieren la necesidad de una mayor dependencia de las mediciones de un solo gusano en la asociación huésped-microbio, así como protocolos para aumentar la precisión y el rendimiento en la interrupción de un solo gusano. Estos protocolos están diseñados para facilitar la interrupción mecánica de un gran número de C. elegans individuales para la cuantificación de la carga bacteriana viable, al tiempo que proporcionan una mejor repetibilidad y un menor esfuerzo por muestra que la interrupción basada en morteros de gusanos individuales. Se incluye un paso recomendado de purga intestinal, donde se permite que los gusanos se alimenten de E. coli muerta por calor antes de la preparación para la interrupción, para minimizar las contribuciones de bacterias recientemente ingeridas y otras bacterias transitorias (no adheridas). Estos protocolos incluyen un método de parálisis en frío para limpiar la cutícula con un tratamiento de lejía superficial de baja concentración; El blanqueamiento de superficies se puede utilizar como un paso preparatorio en la interrupción de un solo gusano o como un método para preparar gusanos vivos, externamente libres de gérmenes. Este método de blanqueamiento de la superficie es suficiente para eliminar una amplia gama de microbios externos, y el tratamiento en frío proporciona una alternativa a la parálisis convencional a base de levamisol; mientras que el levamisol será preferido para experimentos sensibles al frío, la parálisis por frío minimiza las contribuciones a los flujos de desechos peligrosos y permite una rápida reanudación de la actividad normal. Si bien el protocolo completo describe un experimento de laboratorio en el que los gusanos se colonizan con bacterias conocidas, los procedimientos para limpiar los gusanos y la interrupción de un solo gusano se pueden aplicar fácilmente a gusanos aislados de muestras silvestres o colonizados en experimentos de microcosmos. Los protocolos descritos aquí producen bacterias vivas extraídas del intestino del gusano, adecuadas para el recubrimiento y la cuantificación de unidades formadoras de colonias (UFC) en gusanos individuales; para el análisis de la comunidad intestinal basado en la secuenciación, se deben agregar a estos protocolos pasos posteriores de lisis celular y extracción de ácido nucleico.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí se presentan datos sobre las ventajas de la cuantificación de la carga bacteriana en C. elegans, junto con un protocolo de interrupción de 96 pocillos para permitir la adquisición rápida y consistente de grandes conjuntos de datos de este tipo. En comparación con los métodos existentes33, estos protocolos permiten una medición de mayor rendimiento de las comunidades microbianas intestinales en el gusano.
Este enfoque tiene el recubrimiento como un …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean reconocer a H. Schulenberg y C. LaRock por su generoso intercambio de cepas bacterianas utilizadas en estos experimentos. Este trabajo fue apoyado por fondos de la Universidad de Emory y NSF (PHY2014173).
Materials
| 96-well flat-bottom polypropylene plates, 300 uL | Evergreen Labware | 290-8350-03F | |
| 96-well plate sealing mat, silicon, square wells (AxyMat) | Axygen | AM-2ML-SQ | |
| 96-well plates, 2 mL, square wells | Axygen | P-2ML-SQ-C-S | |
| 96-well polypropylene plate lids | Evergreen Labware | 290-8020-03L | |
| Agar | Fisher Scientific | 443570050 | |
| Bead mill adapter set for 96-well plates | QIAGEN | 119900 | Adapter plates for use with two 96-well plates on the TissueLyser II |
| Bead mill tissue homogenizer (TissueLyser II) | QIAGEN | 85300 | Mechanical homogenizer for medium to high-throughput sample disruption |
| BioSorter | Union Biometrica | By quotation | Large object sorter equipped with a 250 micron focus for C. elegans |
| Bleach, commercial, 8.25% sodium hypochlorite | Clorox | ||
| Breathe-Easy 96-well gas permeable sealing membrane | Diversified Biotech | BEM-1 | Multiwell plate gas permeable polyurethane membranes. Thin sealing film is permeable to O2, CO2, and water vapors and is UV transparent down to 300 nm. Sterile, 100/box. |
| Calcium chloride dihydrate | Fisher Scientific | AC423525000 | |
| Cholesterol | VWR | AAA11470-30 | |
| Citric acid monohydrate | Fisher Scientific | AC124910010 | |
| Copper (II) sulfate pentahydrate | Fisher Scientific | AC197722500 | |
| Corning 6765 LSE Mini Microcentrifuge | Corning | COR-6765 | |
| Disodium EDTA | Fisher Scientific | 409971000 | |
| DL 1,4 Dithiothreitol, 99+%, for mol biology, DNAse, RNAse and Protease free, ACROS Organics | Fisher Scientific | 327190010 | |
| Eppendorf 1.5 mL microcentrifuge tubes, natural | Eppendorf | ||
| Eppendorf 5424R microcentrifuge | Eppendorf | 5406000640 | 24-place refrigerated benchtop microcentrifuge |
| Eppendorf 5810R centrifuge with rotor S-4-104 | Eppendorf | 22627040 | 3L benchtop centrifuge with adaptors for 15-50 mL tubes and plates |
| Eppendorf plate bucket (x2), for Rotor S-4-104 | Eppendorf | 22638930 | |
| Ethanol 100% | Fisher Scientific | BP2818500 | |
| Glass beads, 2.7 mm | Life Science Products | LS-79127 | |
| Glass beads, acid-washed, 425-600 µm | Sigma | G877-500G | |
| Glass plating beads | VWR | 76005-124 | |
| Hydrochloric acid | VWR | BDH7204-1 | |
| Iron (II) sulfate heptahydrate | Fisher Scientific | 423731000 | |
| Kimble Kontes pellet pestle motor | DWK Life Sciences | 749540-0000 | |
| Kimble Kontes polypropylene pellet pestles and microtubes, 0.5 mL | DWK Life Sciences | 749520-0590 | |
| Leica DMi8 motorized inverted microscope with motorized stage | Leica | 11889113 | |
| Leica LAS X Premium software | Leica | 11640687 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Fisher Scientific | AC124900010 | |
| Manganese(II) chloride tetrahydrate | VWR | 470301-706 | |
| PARAFILM M flexible laboratory sealing film | Amcor | PM996 | |
| Peptone | Fisher Scientific | BP1420-500 | |
| Petri dishes, round, 10 cm | VWR | 25384-094 | |
| Petri dishes, round, 6 cm | VWR | 25384-092 | |
| Petri dishes, square, 10 x 10 cm | VWR | 10799-140 | |
| Phospho-buffered saline (1X PBS) | Gold Bio | P-271-200 | |
| Polypropylene autoclave tray, shallow | Fisher Scientific | 13-361-10 | |
| Potassium hydroxide | Fisher Scientific | AC134062500 | |
| Potassium phosphate dibasic | Fisher Scientific | BP363-1 | |
| Potassium phosphate monobasic | Fisher Scientific | BP362-1 | |
| R 4.1.3/RStudio 2022.02.0 build 443 | R Foundation | n/a | |
| Scoop-type laboratory spatula, metal | VWR | 470149-438 | |
| Silicon carbide 36 grit | MJR Tumblers | n/a | Black extra coarse silicon carbide grit. Available in 0.5-5 lb sizes from this vendor. |
| Sodium dodecyl sulfate | Fisher Scientific | BP166-100 | |
| Sodium hydroxide | VWR | BDH7247-1 | |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous | Fisher Scientific | BP332-500 | |
| Sodum chloride | Fisher Scientific | BP358-1 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | AC419760010 | |
| Tri-potassium citrate monohydrate | Fisher Scientific | AC611755000 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 | |
| Zinc sulfate heptahydrate | Fisher Scientific | AC205982500 |
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