Verwendung von Einzelwurmdaten zur Quantifizierung der Heterogenität bei Caenorhabditis elegans-bakteriellen Interaktionen
Summary
Dieses Protokoll beschreibt eine 96-Well-Störung einzelner bakteriell besiedelter Caenorhabditis elegans nach Kältelähmung und Oberflächenbleiche, um externe Bakterien zu entfernen. Die resultierende Suspension ist auf Agarplatten plattiert, um eine genaue Quantifizierung der Keimbelastung in einer großen Anzahl einzelner Würmer mit mittlerem Durchsatz zu ermöglichen.
Abstract
Der Fadenwurm Caenorhabditis elegans ist ein Modellsystem für Wirt-Mikroben- und Wirt-Mikrobiom-Interaktionen. Viele Studien verwenden bisher Batch-Digests anstelle von einzelnen Wurmproben, um die Keimbelastung in diesem Organismus zu quantifizieren. Hier wird argumentiert, dass die große interindividuelle Variabilität, die bei der bakteriellen Besiedlung des Darms von C. elegans beobachtet wird, informativ ist und dass Batch-Digest-Methoden Informationen verwerfen, die für einen genauen Vergleich zwischen den Bedingungen wichtig sind. Da die Beschreibung der diesen Proben innewohnenden Variation eine große Anzahl von Individuen erfordert, wird ein praktisches 96-Well-Plattenprotokoll für die Störung und Kolonieplattierung einzelner Würmer erstellt.
Introduction
Heterogenität in Wirt-Mikroben-Assoziationen wird allgegenwärtig beobachtet, und Variationen zwischen Individuen werden zunehmend als beitragender Faktor in Populationsprozessen von Konkurrenz und Koexistenz1 bis zur Krankheitsübertragungerkannt 2,3,4. In C. elegans wurde wiederholt eine “versteckte Heterogenität” innerhalb isogener Populationen beobachtet, wobei Subpopulationen von Individuen unterschiedliche Phänotypen in der Hitzeschockreaktion 5,6, Alterung und Lebensdauer 7,8,9,10,11 und vielen anderen Aspekten der Physiologie und Entwicklung zeigten 12 . Die meisten Analysen, die versuchen, die Subpopulationsstruktur zu identifizieren, liefern Hinweise auf zwei Subpopulationen in experimentellen Populationen von isogenen, synchronisierten Würmern 5,7,8, obwohl andere Daten die Möglichkeit von Verteilungen von Merkmalen innerhalb der Population anstelle von verschiedenen Gruppen nahelegen 7,12,13 . Von Bedeutung ist hierbei, dass eine erhebliche Heterogenität in Darmpopulationen sogar innerhalb isogener Populationen von Würmern beobachtet wird, die aus einer gemeinsamen Quelle von Mikroben 13,14,15,16 besiedelt sind, und diese Heterogenität kann durch die Batch-Digest-Messungen verdeckt werden, die weit verbreitet sind17,18,19,20 für die bakterielle Quantifizierung im Wurm.
Diese Arbeit präsentiert Daten, die auf eine größere Abhängigkeit von Einzelwurmmessungen in der Wirt-Mikroben-Assoziation hindeuten, sowie Protokolle zur Erhöhung der Genauigkeit und des Durchsatzes bei Einzelwurmstörungen. Diese Protokolle wurden entwickelt, um die mechanische Störung einer großen Anzahl einzelner C. elegans zur Quantifizierung der lebensfähigen Keimbelastung zu erleichtern und gleichzeitig eine bessere Wiederholbarkeit und einen geringeren Aufwand pro Probe als die stößelbasierte Störung einzelner Würmer zu bieten. Ein empfohlener Darmspülschritt, bei dem sich Würmer vor der Vorbereitung auf eine Störung von hitzeabgetöteten E. coli ernähren dürfen, ist enthalten, um die Beiträge von kürzlich aufgenommenen und anderen vorübergehenden (nicht anhaftenden) Bakterien zu minimieren. Diese Protokolle umfassen eine Kältelähmungsmethode zur Reinigung der Kutikula mit einer oberflächenschonenden Behandlung mit niedriger Konzentration; Das Oberflächenbleichen kann als vorbereitender Schritt bei der Einzelwurmzerstörung oder als Methode zur Herstellung lebender, äußerlich keimfreier Würmer eingesetzt werden. Diese Oberflächenbleichmethode reicht aus, um eine breite Palette externer Mikroben zu entfernen, und die Kaltbehandlung bietet eine Alternative zur herkömmlichen Lähmung auf Levamisolbasis. Während Levamisol für kälteempfindliche Experimente bevorzugt wird, minimiert die Kältelähmung den Beitrag zu gefährlichen Abfallströmen und ermöglicht eine schnelle Wiederaufnahme der normalen Aktivität. Während das vollständige Protokoll ein Laborexperiment beschreibt, bei dem Würmer mit bekannten Bakterien besiedelt werden, können die Verfahren zur Reinigung von Würmern und Einzelwurmstörungen leicht auf Würmer angewendet werden, die aus Wildproben isoliert oder in Mikrokosmosexperimenten besiedelt werden. Die hier beschriebenen Protokolle produzieren lebende Bakterien, die aus dem Wurmdarm extrahiert werden und für die Beschichtung und Quantifizierung von koloniebildenden Einheiten (CFUs) in einzelnen Würmern geeignet sind; Für die sequenzierungsbasierte Analyse der Darmgemeinschaft sollten diesen Protokollen nachfolgende Zelllyse- und Nukleinsäureextraktionsschritte hinzugefügt werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier werden Daten zu den Vorteilen der Einzelwurmquantifizierung der Bakterienlast in C. elegans sowie ein 96-Well-Disruptionsprotokoll vorgestellt, um die schnelle und konsistente Erfassung großer Datensätze dieses Typs zu ermöglichen. Im Vergleich zu bestehenden Methoden33 ermöglichen diese Protokolle eine höhere Durchsatzmessung von intestinalen mikrobiellen Gemeinschaften im Wurm.
Dieser Ansatz hat Plating als ratenbegrenzenden Schritt und ist nicht wi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren möchten H. Schulenberg und C. LaRock für ihre großzügige gemeinsame Nutzung der in diesen Experimenten verwendeten Bakterienstämme danken. Diese Arbeit wurde durch Mittel der Emory University und der NSF (PHY2014173) unterstützt.
Materials
| 96-well flat-bottom polypropylene plates, 300 uL | Evergreen Labware | 290-8350-03F | |
| 96-well plate sealing mat, silicon, square wells (AxyMat) | Axygen | AM-2ML-SQ | |
| 96-well plates, 2 mL, square wells | Axygen | P-2ML-SQ-C-S | |
| 96-well polypropylene plate lids | Evergreen Labware | 290-8020-03L | |
| Agar | Fisher Scientific | 443570050 | |
| Bead mill adapter set for 96-well plates | QIAGEN | 119900 | Adapter plates for use with two 96-well plates on the TissueLyser II |
| Bead mill tissue homogenizer (TissueLyser II) | QIAGEN | 85300 | Mechanical homogenizer for medium to high-throughput sample disruption |
| BioSorter | Union Biometrica | By quotation | Large object sorter equipped with a 250 micron focus for C. elegans |
| Bleach, commercial, 8.25% sodium hypochlorite | Clorox | ||
| Breathe-Easy 96-well gas permeable sealing membrane | Diversified Biotech | BEM-1 | Multiwell plate gas permeable polyurethane membranes. Thin sealing film is permeable to O2, CO2, and water vapors and is UV transparent down to 300 nm. Sterile, 100/box. |
| Calcium chloride dihydrate | Fisher Scientific | AC423525000 | |
| Cholesterol | VWR | AAA11470-30 | |
| Citric acid monohydrate | Fisher Scientific | AC124910010 | |
| Copper (II) sulfate pentahydrate | Fisher Scientific | AC197722500 | |
| Corning 6765 LSE Mini Microcentrifuge | Corning | COR-6765 | |
| Disodium EDTA | Fisher Scientific | 409971000 | |
| DL 1,4 Dithiothreitol, 99+%, for mol biology, DNAse, RNAse and Protease free, ACROS Organics | Fisher Scientific | 327190010 | |
| Eppendorf 1.5 mL microcentrifuge tubes, natural | Eppendorf | ||
| Eppendorf 5424R microcentrifuge | Eppendorf | 5406000640 | 24-place refrigerated benchtop microcentrifuge |
| Eppendorf 5810R centrifuge with rotor S-4-104 | Eppendorf | 22627040 | 3L benchtop centrifuge with adaptors for 15-50 mL tubes and plates |
| Eppendorf plate bucket (x2), for Rotor S-4-104 | Eppendorf | 22638930 | |
| Ethanol 100% | Fisher Scientific | BP2818500 | |
| Glass beads, 2.7 mm | Life Science Products | LS-79127 | |
| Glass beads, acid-washed, 425-600 µm | Sigma | G877-500G | |
| Glass plating beads | VWR | 76005-124 | |
| Hydrochloric acid | VWR | BDH7204-1 | |
| Iron (II) sulfate heptahydrate | Fisher Scientific | 423731000 | |
| Kimble Kontes pellet pestle motor | DWK Life Sciences | 749540-0000 | |
| Kimble Kontes polypropylene pellet pestles and microtubes, 0.5 mL | DWK Life Sciences | 749520-0590 | |
| Leica DMi8 motorized inverted microscope with motorized stage | Leica | 11889113 | |
| Leica LAS X Premium software | Leica | 11640687 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Fisher Scientific | AC124900010 | |
| Manganese(II) chloride tetrahydrate | VWR | 470301-706 | |
| PARAFILM M flexible laboratory sealing film | Amcor | PM996 | |
| Peptone | Fisher Scientific | BP1420-500 | |
| Petri dishes, round, 10 cm | VWR | 25384-094 | |
| Petri dishes, round, 6 cm | VWR | 25384-092 | |
| Petri dishes, square, 10 x 10 cm | VWR | 10799-140 | |
| Phospho-buffered saline (1X PBS) | Gold Bio | P-271-200 | |
| Polypropylene autoclave tray, shallow | Fisher Scientific | 13-361-10 | |
| Potassium hydroxide | Fisher Scientific | AC134062500 | |
| Potassium phosphate dibasic | Fisher Scientific | BP363-1 | |
| Potassium phosphate monobasic | Fisher Scientific | BP362-1 | |
| R 4.1.3/RStudio 2022.02.0 build 443 | R Foundation | n/a | |
| Scoop-type laboratory spatula, metal | VWR | 470149-438 | |
| Silicon carbide 36 grit | MJR Tumblers | n/a | Black extra coarse silicon carbide grit. Available in 0.5-5 lb sizes from this vendor. |
| Sodium dodecyl sulfate | Fisher Scientific | BP166-100 | |
| Sodium hydroxide | VWR | BDH7247-1 | |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous | Fisher Scientific | BP332-500 | |
| Sodum chloride | Fisher Scientific | BP358-1 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | AC419760010 | |
| Tri-potassium citrate monohydrate | Fisher Scientific | AC611755000 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 | |
| Zinc sulfate heptahydrate | Fisher Scientific | AC205982500 |
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