एमआरआई, ऊतक समाशोधन और लाइट-शीट माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके पूरे मस्तिष्क एकल-कोशिका इमेजिंग और बरकरार नवजात माउस दिमाग का विश्लेषण
Summary
यह प्रोटोकॉल आईडीआईएससीओ + का उपयोग करके बरकरार माउस दिमाग के चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग, समाशोधन और इम्यूनोलेबलिंग के संचालन के तरीकों का वर्णन करता है, इसके बाद लाइट-शीट माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके इमेजिंग का विस्तृत विवरण और न्यूमोर्फ का उपयोग करके डाउनस्ट्रीम विश्लेषण करता है।
Abstract
लाइट-शीट माइक्रोस्कोपी (एलएसएफएम) के बाद ऊतक समाशोधन बरकरार मस्तिष्क संरचना के सेलुलर-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग को सक्षम बनाता है, जिससे आनुवंशिक या पर्यावरणीय गड़बड़ी के कारण संरचनात्मक परिवर्तनों के मात्रात्मक विश्लेषण की अनुमति मिलती है। पूरे मस्तिष्क इमेजिंग के परिणामस्वरूप कोशिकाओं की अधिक सटीक मात्रा और क्षेत्र-विशिष्ट मतभेदों का अध्ययन होता है जो शारीरिक रूप से विभाजित ऊतक के आमतौर पर उपयोग की जाने वाली माइक्रोस्कोपी के साथ याद किया जा सकता है। साफ़ किए गए दिमाग की छवि के लिए लाइट-शीट माइक्रोस्कोपी का उपयोग करने से कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी की तुलना में अधिग्रहण की गति बहुत बढ़ जाती है। यद्यपि ये छवियां बहुत बड़ी मात्रा में मस्तिष्क संरचनात्मक डेटा का उत्पादन करती हैं, अधिकांश कम्प्यूटेशनल उपकरण जो साफ ऊतक की छवियों में सुविधा परिमाणीकरण करते हैं, सभी नाभिकों के बजाय विरल सेल आबादी की गिनती तक सीमित हैं।
यहां, हम न्यूमोर्फ (परमाणु-आधारित मॉर्फोमेट्री), विश्लेषण उपकरणों का एक समूह प्रदर्शित करते हैं, जो एक प्रकाश-शीट माइक्रोस्कोप पर समाशोधन और इमेजिंग के बाद प्रसवोत्तर दिन 4 (पी 4) माउस मस्तिष्क के एनोटेट क्षेत्रों के भीतर सभी नाभिक और परमाणु मार्करों को निर्धारित करने के लिए है। हम चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग (एमआरआई) का वर्णन ऊतक समाशोधन निर्जलीकरण चरणों के कारण होने वाले संकोचन से पहले मस्तिष्क की मात्रा को मापने के लिए करते हैं, इम्यूनोलेबलिंग सहित आईडीआईएससीओ + विधि का उपयोग करके ऊतक समाशोधन, इसके बाद सेलुलर रिज़ॉल्यूशन पर माउस दिमाग की छवि बनाने के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध मंच का उपयोग करके लाइट-शीट माइक्रोस्कोपी का उपयोग करते हैं। फिर हम न्यूमोर्फ का उपयोग करके इस छवि विश्लेषण पाइपलाइन का प्रदर्शन करते हैं, जिसका उपयोग तीव्रता अंतर को ठीक करने, छवि टाइलों को सिलाई करने, कई चैनलों को संरेखित करने, नाभिक की गणना करने और सार्वजनिक रूप से उपलब्ध एटलस में पंजीकरण के माध्यम से मस्तिष्क क्षेत्रों को एनोटेट करने के लिए किया जाता है।
हमने सार्वजनिक रूप से उपलब्ध प्रोटोकॉल और सॉफ्टवेयर का उपयोग करके इस दृष्टिकोण को डिजाइन किया, जिससे किसी भी शोधकर्ता को इन तकनीकों को करने के लिए आवश्यक माइक्रोस्कोप और कम्प्यूटेशनल संसाधनों की अनुमति मिली। ये ऊतक समाशोधन, इमेजिंग और कम्प्यूटेशनल उपकरण कॉर्टेक्स में सेल-प्रकारों के त्रि-आयामी (3 डी) संगठन के माप और परिमाणीकरण की अनुमति देते हैं और किसी भी जंगली-प्रकार / नॉकआउट माउस अध्ययन डिजाइन पर व्यापक रूप से लागू होना चाहिए।
Introduction
एकल-कोशिका संकल्प पर पूरे मस्तिष्क इमेजिंग तंत्रिका विज्ञान में एक महत्वपूर्ण चुनौती है। सेलुलर-रिज़ॉल्यूशन मस्तिष्क छवियां मस्तिष्क सर्किटरी के विस्तृत विश्लेषण और सिस्टम-स्तरीय मानचित्रण की अनुमति देती हैं और न्यूरोसाइकिएट्रिक विकारों, विकासशील भ्रूण में सेलुलर व्यवहार, साथ ही वयस्क मस्तिष्क में तंत्रिका सर्किट के लिए आनुवंशिक या पर्यावरणीय जोखिम कारकों द्वारा सर्किटरीकैसे बाधित होती है। कई हिस्टोलॉजिकल विधियां हैं जो पुनर्निर्मित 3 डी मस्तिष्क की उच्च-रिज़ॉल्यूशन छवियों की अनुमति देती हैं; हालांकि, इन तकनीकों को महंगे, विशेष उपकरणों की आवश्यकता होती है, इम्यूनोलेबलिंग के साथ संगत नहीं हो सकते हैं, और कुछ तरीकों की दो-आयामी (2 डी) प्रकृति से सेक्शनिंग 4,5 के दौरान ऊतक क्षति और कतरन हो सकता है।
हाल की प्रगति ने पूरे दिमाग की इमेजिंग के लिए एक वैकल्पिक दृष्टिकोण प्रदान किया है जिसे ऊतक सेक्शनिंग की आवश्यकता नहीं है; वे दिमाग को पारदर्शी बनाने के लिए ऊतक समाशोधन का उपयोग करना शामिल करते हैं। लिपिड को हटाकर अधिकांश ऊतक समाशोधन विधियों में पारदर्शिता प्राप्त की जाती है, क्योंकि वे प्रकाश प्रकीर्णन का एक प्रमुख स्रोत हैं, और इमेजिंग के दौरान नमूना विसर्जन समाधान के आरआई के साथ वस्तु के अपवर्तक सूचकांक (आरआई) का मिलान करते हैं। प्रकाश तब बिखरे हुए 6,7,8,9 के बिना सामग्री के बीच की सीमा से गुजर सकता है।
ऊतक समाशोधन विधियों, जैसे कि आईडीआईएससीओ +, को अक्सर एकल-फोटॉन उत्तेजना माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके तेजी से 3 डी इमेजिंग के साथ जोड़ा जाता है, जैसे कि एलएसएफएम 6,7,10। फ्लोरोफोरे के साथ लेबल किए गए पारदर्शी ऊतकों के भीतर, प्रकाश-शीट फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी प्रकाश 11 के पतले विमान के साथ उत्तेजना द्वारा वर्गों कोचित्रित करती है। एलएसएफएम का मुख्य लाभ यह है कि एक एकल ऑप्टिकल खंड एक समय में रोशन होता है, जिसमें उस खंड के भीतर अणुओं से सभी प्रतिदीप्ति उत्तेजित होती है, जो फोटोब्लीचिंग को कम करती है। इसके अलावा, एक पूरे ऑप्टिकल स्लाइस की इमेजिंग उस उत्तेजित स्लाइस का कैमरा-आधारित पता लगाने में सक्षम बनाती है, जिससे पॉइंट स्कैनिंग12 के सापेक्ष गति बढ़ जाती है। एलएसएफएम गैर-विनाशकारी रूप से अच्छी तरह से पंजीकृत ऑप्टिकल वर्गों का उत्पादन करता है जो 3 डी पुनर्निर्माण के लिए उपयुक्त हैं।
जबकि आईडीआईएससीओ + विधि ~ 3 सप्ताह के भीतर सस्ती ऊतक समाशोधन की अनुमति देती है, प्रोटोकॉल के भीतर निर्जलीकरण चरणों से ऊतक संकोचन और नमूना आकृति विज्ञान का संभावित परिवर्तन हो सकता है, इस प्रकार वॉल्यूमेट्रिक माप 6,10 को प्रभावित कर सकता है। ऊतक समाशोधन प्रक्रिया से पहले उपयोग की जाने वाली एमआरआई जैसी द्वितीयक इमेजिंग विधि को जोड़ना नमूने में ऊतक समाशोधन-प्रेरित संकोचन की डिग्री को माप सकता है। निर्जलीकरण चरणों के दौरान, ग्रे और सफेद पदार्थ के बीच यांत्रिक गुणों में अंतर से गैर-समान मस्तिष्क पदार्थ विरूपण हो सकता है, जिसके परिणामस्वरूप जंगली-प्रकार और उत्परिवर्ती नमूनों के बीच असमान ऊतक समाशोधन-प्रेरित मात्रा विरूपण हो सकता है और इन नमूनों में वॉल्यूमेट्रिक अंतर की व्याख्या को भ्रमित कर सकताहै 10,13 . एमआरआई पहले जानवर को एक कंट्रास्ट एजेंट (जैसे, गैडोलीनियम) के साथ जोड़कर किया जाता है, इसके बाद इमेजिंग14 से पहले विसर्जन समाधान (जैसे, फोम्ब्लिन) में रुचि के निकाले गए ऊतक को इंजेक्ट किया जाता है। एमआरआई ऊतक समाशोधन और एक ही नमूने पर एलएसएफएम करने के साथ संगत है।
एलएसएफएम का उपयोग अक्सर मस्तिष्क संरचना के मात्रात्मक मूल्यांकन के बजाय रुचि के मस्तिष्क ऊतक के गुणात्मक विज़ुअलाइज़ेशन के लिए बड़े पैमाने पर माइक्रोस्कोपी छवियां बनाने के लिए किया जाता है (चित्रा 1)। मात्रात्मक मूल्यांकन के बिना, आनुवंशिक या पर्यावरणीय अपमान के परिणामस्वरूप संरचनात्मक अंतर प्रदर्शित करना मुश्किल है। चूंकि ऊतक-समाशोधन और इमेजिंग प्रौद्योगिकियों में सुधार होता है, भंडारण और कंप्यूटिंग शक्ति की लागत में कमी के साथ, रुचि के ऊतक के भीतर सेल प्रकार के स्थानीयकरण की मात्रा निर्धारित करना अधिक सुलभ होता जा रहा है, जिससे अधिक शोधकर्ता इन आंकड़ों को अपने अध्ययन में शामिल कर सकते हैं।
माउस मस्तिष्क15 और पूरे मस्तिष्क इमेजिंग सत्रों में 100 मिलियन से अधिक कोशिकाओं के साथ जो डेटा के टेराबाइट उत्पन्न कर सकते हैं, उन्नत छवि विश्लेषण उपकरणों की मांग बढ़ जाती है जो छवियों के भीतर सुविधाओं की सटीक मात्रा की अनुमति देते हैं, जैसे कि कोशिकाएं। ऊतक-साफ़ छवियों के लिए विभाजन विधियों की एक मेजबानी मौजूद है जो परमाणु धुंधला तीव्रता के लिए दहलीज लागू करती है और पूर्वनिर्धारित आकृतियों, आकारों या घनत्व10,16,17,18 के साथ वस्तुओं को फ़िल्टर करती है। हालांकि, परिणामों की गलत व्याख्या सेल आकार, छवि कंट्रास्ट और लेबलिंग तीव्रता जैसे मापदंडों में भिन्नता से उत्पन्न हो सकती है। यह पेपर माउस मस्तिष्क में सेल नाभिक को निर्धारित करने के लिए हमारे स्थापित प्रोटोकॉल का वर्णन करता है। सबसे पहले, हम पी 4 माउस मस्तिष्क के ऊतक संग्रह के लिए चरणों का विस्तार करते हैं, इसके बाद सार्वजनिक रूप से उपलब्ध आईडीआईएससीओ + विधि10 से अनुकूलित ऊतक समाशोधन और इम्यूनोलेबलिंग प्रोटोकॉल। दूसरा, हम एमआरआई और लाइट-शीट माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके छवि अधिग्रहण का वर्णन करते हैं, जिसमें छवियों को कैप्चर करने के लिए उपयोग किए जाने वाले पैरामीटर शामिल हैं। अंत में, हम न्यूमोर्फ19 का वर्णन और प्रदर्शन करते हैं, हमारे समूह द्वारा विकसित छवि विश्लेषण उपकरणों का एक सेट जो ऊतक समाशोधन, परमाणु मार्करों के साथ इम्यूनोलेबलिंग और एनोटेटेड क्षेत्रों की लाइट-शीट इमेजिंग के बाद सेल-प्रकार विशिष्ट परिमाणीकरण की अनुमति देता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
ऊतक समाशोधन विधियां मस्तिष्क के 3 डी सेलुलर संगठन को मापने के लिए उपयोगी तकनीकें हैं। साहित्य में वर्णित ऊतक समाशोधन विधियों की एक मेजबानी है, जिनमें से प्रत्येक के फायदे और सीमाएं 6,7,8,9 हैं?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को एनआईएच (R01MH121433, R01MH118349, और R01MH120125 से JLS और R01NS110791 से GW) और फाउंडेशन ऑफ होप द्वारा समर्थित किया गया था। हम नमूना इमेजिंग में सहायता के लिए माइक्रोस्कोपी सेवा प्रयोगशाला के पाब्लो एरियल को धन्यवाद देते हैं। पैथोलॉजी और प्रयोगशाला चिकित्सा विभाग में माइक्रोस्कोपी सेवा प्रयोगशाला उत्तरी कैरोलिना विश्वविद्यालय (यूएनसी) लाइनबर्गर कॉम्प्रिहेंसिव कैंसर सेंटर को कैंसर सेंटर कोर सपोर्ट ग्रांट पी 30 सीए 016086 द्वारा समर्थित है। न्यूरोसाइंस माइक्रोस्कोपी कोर अनुदान पी 30 एनएस 045892 द्वारा समर्थित है। इस प्रकाशन में रिपोर्ट किए गए शोध को उत्तरी कैरोलिना बायोटेक सेंटर इंस्टीट्यूशनल सपोर्ट ग्रांट 2016-आईडीजी -1016 द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| Bruker 9.4T/30 cm MRI Scanner | Bruker Biospec | Horizontal Bore Animal MRI System | |
| Dibenzyl ether | Sigma-Aldrich | 108014-1KG | |
| Dichloromethane (DCM) | Sigma-Aldrich | 270997-1L | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher-Scientific | ICN19605590 | |
| Donkey serum | Sigma-Aldrich | S30-100ML | |
| EVO 860 4TB external SSD | |||
| Fomblin Y | Speciality Fluids Company | YL-VAC-25-6 | perfluoropolyether lubricant |
| gadolinium contrast agent (ProHance) | Bracco Diagnostics | A9576 | |
| gadolinium contrast agent(ProHance) | Bracco Diagnostics | 0270-1111-03 | |
| GeForce GTX 1080 Ti 11GB GPU | EVGA | 08G-P4-6286-KR | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G7126-500G | |
| Heparin sodium salt | Sigma-Aldrich | H3393-10KU | Dissolved in H2O to 10 mg/mL |
| Hydrogen peroxide solution, 30% | Sigma-Aldrich | H1009-100ML | |
| ImSpector Pro | LaVision BioTec | Microscope image acquisition software | |
| ITK Snap | segmentation software | ||
| Methanol | Fisher-Scientific | A412SK-4 | |
| MVPLAPO 2x/0.5 NA Objective | Olympus | ||
| Paraformaldehyde, powder, 95% (PFA) | Sigma-Aldrich | 30525-89-4 | Dissolved in 1x PBS to 4% |
| Phosphate Buffered Saline 10x (PBS) | Corning | 46-013-CM | Diluted to 1x in H2O |
| Sodium Azide | Sigma-Aldrich | S2002-100G | Dissolved in H2O to 10% |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750-10G | |
| Tergitol type NP-40 | Sigma-Aldrich | NP40S-100ML | |
| TritonX-100 | Sigma-Aldrich | T8787-50ML | |
| Tween-20 | Fisher-Scientific | BP337 500 | |
| Ultramicroscope II Light Sheet Microscope | LaVision BioTec | ||
| Xeon Processor E5-2690 v4 | Intel | E5-2690 | |
| Zyla sCMOS Camera | Andor | Complementary metal oxide semiconductor camera | |
| Antibody | Working concentration | ||
| Alexa Fluor Goat 790 Anti-Rabbit | Thermofisher Scientific | A11369 | (1:50) |
| Alexa Fluor Goat 568 Anti-Rat | Thermofisher Scientific | A11077 | (1:200) |
| Rat anti-Ctip2 | Abcam | ab18465 | (1:400) |
| Rabbit anti-Brn2 | Cell Signaling Technology | 12137 | (1:100) |
| To-Pro 3 (TP3) | Thermofisher Scientific | T3605 | (1:400) |
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