Helhjärna encellig avbildning och analys av intakta neonatala mushjärnor med hjälp av MR, vävnadsrensning och ljusarkmikroskopi

Summary

Detta protokoll beskriver metoder för att genomföra magnetisk resonansavbildning, rensning och immunmärkning av intakta mushjärnor med hjälp av iDISCO+, följt av en detaljerad beskrivning av avbildning med hjälp av ljusarkmikroskopi och nedströmsanalyser med NuMorph.

Abstract

Vävnadsrensning följt av ljusarkmikroskopi (LSFM) möjliggör cellulär upplösningsavbildning av intakt hjärnstruktur, vilket möjliggör kvantitativ analys av strukturella förändringar orsakade av genetiska eller miljömässiga störningar. Helhjärnavbildning resulterar i mer exakt kvantifiering av celler och studier av regionspecifika skillnader som kan missas med vanligt förekommande mikroskopi av fysiskt snittad vävnad. Att använda ljusarkmikroskopi för att avbilda rensade hjärnor ökar förvärvshastigheten kraftigt jämfört med konfokalmikroskopi. Även om dessa bilder producerar mycket stora mängder hjärnstrukturdata, är de flesta beräkningsverktyg som utför funktionskvantifiering i bilder av rensad vävnad begränsade till att räkna glesa cellpopulationer, snarare än alla kärnor.

Här demonstrerar vi NuMorph (Nuclear-Based Morphometry), en grupp analysverktyg, för att kvantifiera alla kärnor och kärnmarkörer inom kommenterade regioner i en postnatal dag 4 (P4) mushjärna efter rensning och avbildning på ett ljusarkmikroskop. Vi beskriver magnetisk resonanstomografi (MRI) för att mäta hjärnvolymen före krympning orsakad av vävnadsrensande uttorkningssteg, vävnadsrensning med iDISCO+-metoden, inklusive immunmärkning, följt av ljusarkmikroskopi med hjälp av en kommersiellt tillgänglig plattform för att avbilda mushjärnor med cellulär upplösning. Vi demonstrerar sedan den här bildanalyspipelinen med NuMorph, som används för att korrigera intensitetsskillnader, sy bildpaneler, justera flera kanaler, räkna kärnor och kommentera hjärnregioner genom registrering till offentligt tillgängliga atlaser.

Vi utformade detta tillvägagångssätt med hjälp av offentligt tillgängliga protokoll och programvara, så att alla forskare med nödvändiga mikroskop och beräkningsresurser kan utföra dessa tekniker. Dessa vävnadsrensnings-, avbildnings- och beräkningsverktyg möjliggör mätning och kvantifiering av den tredimensionella (3D) organisationen av celltyper i cortex och bör vara allmänt tillämplig på alla vilda typer / knockout-musstudiedesigner.

Introduction

Helhjärnavbildning med encellsupplösning är en viktig utmaning inom neurovetenskapen. Hjärnbilder med cellulär upplösning möjliggör detaljerad analys och kartläggning på systemnivå av hjärnkretsar och hur dessa kretsar störs av genetiska eller miljömässiga riskfaktorer för neuropsykiatriska störningar, cellulärt beteende vid utveckling av embryon samt neurala kretsar i den vuxna hjärnan ^1,2,3. Det finns flera histologiska metoder som möjliggör högupplösta bilder av den rekonstruerade 3D-hjärnan; Dessa tekniker kräver dock dyr, specialiserad utrustning, kanske inte är kompatibel med immunmärkning, och den tvådimensionella (2D) karaktären hos vissa metoder kan leda till vävnadsskada och skjuvning under sektionering ^4,5.

De senaste framstegen har gett ett alternativt tillvägagångssätt för avbildning av hela hjärnor som inte kräver vävnadssektionering; De handlar om att använda vävnadsrensning för att göra hjärnor transparenta. Transparens uppnås i de flesta vävnadsrensningsmetoder genom att både ta bort lipider, eftersom de är en viktig källa till ljusspridning, och matcha objektets brytningsindex (RI) med RI för provets nedsänkningslösning under avbildning. Ljus kan sedan passera genom gränsen mellan material utan att spridas 6,7,8,9.

Vävnadsrensningsmetoder, såsom iDISCO+, kombineras ofta med snabb 3D-avbildning med hjälp av excitationsmikroskopi med en foton, såsom LSFM ^6,7,10. I transparenta vävnader märkta med en fluorofor, ljusark fluorescensmikroskopi bilder sektioner genom excitation med ett tunt plan av ljus¹¹. Den största fördelen med LSFM är att en enda optisk sektion belyses åt gången, med all fluorescens från molekylerna inom den sektionen upphetsad, vilket minimerar fotoblekning. Dessutom möjliggör avbildning av en hel optisk skiva kamerabaserad detektering av den upphetsade skivan, vilket ökar hastigheten i förhållande till punktskanning¹². LSFM producerar icke-förstörande välregistrerade optiska sektioner som är lämpliga för 3D-rekonstruktion.

Medan iDISCO + -metoden möjliggör billig vävnadsrensning inom ~ 3 veckor, kan uttorkningssteg i protokollet leda till vävnadskrympning och potentiell förändring av provmorfologin, vilket påverkar volymetriska mätningar ^6,10. Genom att lägga till en sekundär avbildningsmetod, såsom MRI, som ska användas före vävnadsrensningsproceduren kan man mäta graden av vävnadsrensningsinducerad krympning över provet. Under uttorkningsstegen kan skillnader i mekaniska egenskaper mellan grå och vit substans leda till deformationer av icke-enhetlig hjärnsubstans, vilket resulterar i olika vävnadsrensningsinducerade volymdeformationer mellan vildtyps- och mutantprover och kan förvirra tolkningar av volymetriska skillnader i dessa prover^10,13 . MRT utförs genom att först perfuusera djuret med ett kontrastmedel (t.ex. gadolinium), följt av inkubering av den extraherade vävnaden av intresse i en nedsänkningslösning (t.ex. fomblin) före avbildning¹⁴. MR är kompatibel med vävnadsrensning och utförande av LSFM på samma prov.

LSFM används ofta för att skapa storskaliga mikroskopibilder för kvalitativ visualisering av hjärnvävnaden av intresse snarare än kvantitativ utvärdering av hjärnstrukturen (figur 1). Utan kvantitativ utvärdering är det svårt att påvisa strukturella skillnader till följd av genetiska eller miljömässiga förolämpningar. I takt med att vävnadsrensnings- och avbildningstekniken förbättras, tillsammans med minskade kostnader för lagring och datorkraft, blir kvantifiering av celltypslokaliseringar inom vävnaden av intresse mer tillgängliga, vilket gör det möjligt för fler forskare att inkludera dessa data i sina studier.

Med över 100 miljoner celler i mushjärnan¹⁵ och helhjärnavbildningssessioner som kan generera terabyte data, finns det ökad efterfrågan på avancerade bildanalysverktyg som möjliggör exakt kvantifiering av funktioner i bilderna, till exempel celler. Det finns en mängd segmenteringsmetoder för vävnadsrensade bilder som tillämpar tröskelvärde för kärnfärgningsintensitet och filtrerar objekt med fördefinierade former, storlekar eller densiteter^10,16,17,18. Felaktiga tolkningar av resultat kan dock uppstå på grund av variationer i parametrar som cellstorlek, bildkontrast och märkningsintensitet. Detta dokument beskriver vårt etablerade protokoll för att kvantifiera cellkärnor i mushjärnan. Först beskriver vi steg för vävnadsinsamling av P4-mushjärnan, följt av ett vävnadsrensnings- och immunmärkningsprotokoll optimerat från den offentligt tillgängliga iDISCO + -metoden¹⁰. För det andra beskriver vi bildförvärv med hjälp av MR och ljusarkmikroskopi, inklusive de parametrar som används för att ta bilder. Slutligen beskriver och demonstrerar vi NuMorph¹⁹, en uppsättning bildanalysverktyg som vår grupp har utvecklat som möjliggör celltypspecifik kvantifiering efter vävnadsrensning, immunmärkning med kärnmarkörer och ljusarkavbildning av kommenterade regioner.

Protocol

Alla möss användes i enlighet med och godkändes av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) vid University of North Carolina at Chapel Hill. 1. Musdissektion och perfusion OBS: Följande dissektioner utfördes på P4- och P14-möss med hjälp av en spruta. Volymen av perfusionsvätska varierar beroende på djurets ålder. PerfusionVARNING: Paraformaldehyd (PFA) är en farlig kemikalie. Utför alla perfusionssteg i en kemi…

Representative Results

Eftersom iDISCO+-protokollet introducerar betydande vävnadskrympning, vilket lätt märks av ögat (figur 2B), lade vi till ett MR-steg i denna pipeline före vävnadsrensning för att kvantifiera krympningen som induceras av vävnadsrensning. Arbetsflödet börjar med att ta bort icke-hjärnvävnaden från MR-bilden (figur 2C). Därefter appliceras en styv transformation (3 översättnings- och 3 rotationsvinklar) för att justera MR-bilden till ljusarkbilden …

Discussion

Vävnadsrensningsmetoder är användbara tekniker för att mäta 3D-cellulär organisation av hjärnan. Det finns en mängd vävnadsrensningsmetoder som beskrivs i litteraturen, var och en med sina fördelar och begränsningar 6,7,8,9. Alternativen för beräkningsverktyg för att analysera celltyperna i de vävnadsrensade bilderna är relativt begränsade. Andra tillgängliga verktyg har imple…

Materials

Bruker 9.4T/30 cm MRI Scanner	Bruker Biospec		Horizontal Bore Animal MRI System
Dibenzyl ether	Sigma-Aldrich	108014-1KG
Dichloromethane (DCM)	Sigma-Aldrich	270997-1L
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Fisher-Scientific	ICN19605590
Donkey serum	Sigma-Aldrich	S30-100ML
EVO 860 4TB external SSD
Fomblin Y	Speciality Fluids Company	YL-VAC-25-6	perfluoropolyether lubricant
gadolinium contrast agent (ProHance)	Bracco Diagnostics	A9576
gadolinium contrast agent(ProHance)	Bracco Diagnostics	0270-1111-03
GeForce GTX 1080 Ti 11GB GPU	EVGA	08G-P4-6286-KR
Glycine	Sigma-Aldrich	G7126-500G
Heparin sodium salt	Sigma-Aldrich	H3393-10KU	Dissolved in H2O to 10 mg/mL
Hydrogen peroxide solution, 30%	Sigma-Aldrich	H1009-100ML
ImSpector Pro	LaVision BioTec		Microscope image acquisition software
ITK Snap			segmentation software
Methanol	Fisher-Scientific	A412SK-4
MVPLAPO 2x/0.5 NA Objective	Olympus
Paraformaldehyde, powder, 95% (PFA)	Sigma-Aldrich	30525-89-4	Dissolved in 1x PBS to 4%
Phosphate Buffered Saline 10x (PBS)	Corning	46-013-CM	Diluted to 1x in H2O
Sodium Azide	Sigma-Aldrich	S2002-100G	Dissolved in H2O to 10%
Sodium deoxycholate	Sigma-Aldrich	D6750-10G
Tergitol type NP-40	Sigma-Aldrich	NP40S-100ML
TritonX-100	Sigma-Aldrich	T8787-50ML
Tween-20	Fisher-Scientific	BP337 500
Ultramicroscope II Light Sheet Microscope	LaVision BioTec
Xeon Processor E5-2690 v4	Intel	E5-2690
Zyla sCMOS Camera	Andor		Complementary metal oxide semiconductor camera
Antibody			Working concentration
Alexa Fluor Goat 790 Anti-Rabbit	Thermofisher Scientific	A11369	(1:50)
Alexa Fluor Goat 568 Anti-Rat	Thermofisher Scientific	A11077	(1:200)
Rat anti-Ctip2	Abcam	ab18465	(1:400)
Rabbit anti-Brn2	Cell Signaling Technology	12137	(1:100)
To-Pro 3 (TP3)	Thermofisher Scientific	T3605	(1:400)