फॉस्फोलिपिड मध्यस्थ प्रेरित तीन आयामी संस्कृतियों में परिवर्तन
Summary
वर्तमान प्रोटोकॉल एक गैर-रूपांतरित स्तन उपकला सेल लाइन, एमसीएफ 10 ए की 3 डी ‘ऑन टॉप’ संस्कृतियों की स्थापना का वर्णन करता है, जिसे प्लेटलेट एक्टिवेटिंग फैक्टर (पीएएफ) प्रेरित परिवर्तन का अध्ययन करने के लिए संशोधित किया गया है। परिवर्तन का आकलन करने के लिए इम्यूनो-प्रतिदीप्ति का उपयोग किया गया है और विस्तार से चर्चा की गई है।
Abstract
कैंसर का अध्ययन करने के लिए कई मॉडल विकसित किए गए हैं, जैसे कृंतक मॉडल और स्थापित सेल लाइनें। इन मॉडलों का उपयोग करके अध्ययन द्वारा कार्सिनोजेनेसिस में मूल्यवान अंतर्दृष्टि प्रदान की गई है। सेल लाइनों ने स्तन ट्यूमरजेनेसिस से जुड़े आणविक सिग्नलिंग के विनियमन की समझ प्रदान की है, जबकि कृंतक मॉडल का व्यापक रूप से विवो में स्तन कैंसर की सेलुलर और आणविक विशेषताओं का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया जाता है। स्तन उपकला और कैंसर कोशिकाओं की 3 डी संस्कृतियों की स्थापना इन विट्रो में विवो स्थितियों की नकल करके विवो और इन विट्रो मॉडल के बीच की खाई को पाटने में सहायता करती है। इस मॉडल का उपयोग जटिल आणविक सिग्नलिंग घटनाओं और स्तन कार्सिनोजेनेसिस के दौरान सेलुलर विशेषताओं के विनियमन को समझने के लिए किया जा सकता है। यहां, फॉस्फोलिपिड मध्यस्थ-प्रेरित (प्लेटलेट एक्टिवेटिंग फैक्टर, पीएएफ) परिवर्तन का अध्ययन करने के लिए एक 3 डी संस्कृति प्रणाली को संशोधित किया गया है। इम्यूनोमोड्यूलेटर और अन्य स्रावित अणु स्तन में ट्यूमर दीक्षा और प्रगति में एक प्रमुख भूमिका निभाते हैं। वर्तमान अध्ययन में, स्तन उपकला कोशिकाओं की 3 डी एसिनार संस्कृतियों को पीएएफ के संपर्क में लाया जाता है, जो ध्रुवीयता के नुकसान और परिवर्तित सेलुलर विशेषताओं जैसे परिवर्तन विशेषताओं का प्रदर्शन करते हैं। यह 3 डी संस्कृति प्रणाली ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट में विभिन्न छोटे अणु संस्थाओं द्वारा प्रेरित आनुवंशिक और / या एपिजेनेटिक गड़बड़ी पर प्रकाश डालने में सहायता करेगी। इसके अतिरिक्त, यह प्रणाली उपन्यास के साथ-साथ ज्ञात जीनों की पहचान के लिए एक मंच भी प्रदान करेगी जो परिवर्तन की प्रक्रिया में शामिल हो सकते हैं।
Introduction
कैंसर की प्रगति का अध्ययन करने के लिए असंख्य मॉडल उपलब्ध हैं, उनमें से प्रत्येक अद्वितीय है और इस जटिल बीमारी के उपप्रकार का प्रतिनिधित्व करता है। प्रत्येक मॉडल कैंसर जीव विज्ञान में अद्वितीय और मूल्यवान अंतर्दृष्टि प्रदान करता है और वास्तविक बीमारी की स्थिति की नकल करने के साधनों में सुधार किया है। मोनोलेयर के रूप में विकसित स्थापित सेल लाइनों ने इन विट्रो में महत्वपूर्ण प्रक्रियाओं में मूल्यवान अंतर्दृष्टि प्रदान की है, जैसे कि प्रसार, आक्रामकता, प्रवासन और एपोप्टोसिस1. यद्यपि दो आयामी (2 डी) सेल संस्कृति कई पर्यावरणीय गड़बड़ी के लिए स्तनधारी कोशिकाओं की प्रतिक्रिया की जांच करने के लिए पारंपरिक उपकरण रहा है, ऊतक-स्तरीय प्रतिक्रियाओं की भविष्यवाणी करने के लिए इन निष्कर्षों का एक्सट्रपलेशन पर्याप्त रूप से आश्वस्त नहीं लगता है। 2 डी संस्कृतियों की प्रमुख सीमा यह है कि बनाया गया माइक्रोएन्वायरमेंट स्तन ऊतक से काफी हद तक भिन्न होता है2. 2 डी संस्कृति में बाह्य मैट्रिक्स के साथ कोशिकाओं की बातचीत का अभाव है, जो किसी भी ऊतक के विकास के लिए महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, मोनोलेयर संस्कृतियों में सेल द्वारा अनुभव की जाने वाली तन्यता बल इन कोशिकाओं की ध्रुवीयता में बाधा डालती हैं, इस प्रकार सेल सिग्नलिंग और व्यवहार 3,4,5 को बदल देती हैं। त्रि-आयामी (3 डी) संस्कृति प्रणालियों ने इन विट्रो में विवो स्थितियों की नकल करने की अपनी क्षमता के साथ कैंसर अनुसंधान के क्षेत्र में एक नया एवेन्यू खोला है। 2 डी सेल संस्कृति में खो जाने वाले कई महत्वपूर्ण माइक्रोएनवायरनमेंटल संकेतों को लैमिनिन समृद्ध बाह्य मैट्रिक्स (एलआरईसीएम) 6 की 3 डी संस्कृतियों का उपयोग करके फिर से स्थापित किया जा सकता है।
विभिन्न अध्ययनों ने कार्सिनोजेनेसिस 7,8 में ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट के महत्व की पहचान की है। सूजन से जुड़े कारक माइक्रोएन्वायरमेंट का एक प्रमुख हिस्सा हैं। प्लेटलेट एक्टिवेटिंग फैक्टर (पीएएफ) विभिन्न प्रतिरक्षा कोशिकाओं द्वारा स्रावित एक फॉस्फोलिपिड मध्यस्थ है जो कई प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं 9,10 की मध्यस्थता करता है। पीएएफ के उच्च स्तर विभिन्न स्तन कैंसर सेल लाइनों द्वारा स्रावित होते हैं और बढ़े हुए प्रसार11 से जुड़े होते हैं। हमारी प्रयोगशाला के अध्ययनों से पता चला है कि एसिनार संस्कृतियों में पीएएफ की लंबे समय तक उपस्थिति स्तन उपकला कोशिकाओं के परिवर्तन की ओर ले जाती है12. पीएएफ पीएएफ रिसेप्टर (पीएएफआर) को सक्रिय करता है, पीआई 3 के / एक्ट सिग्नलिंग अक्ष13 को सक्रिय करता है। पीएएफआर को ईएमटी, आक्रमण और मेटास्टेसिस14 से भी जुड़ा होने की सूचना है।
वर्तमान प्रोटोकॉल स्तन उपकला कोशिकाओं की 3 डी संस्कृतियों का उपयोग करके पीएएफ-प्रेरित परिवर्तन का अध्ययन करने के लिए एक मॉडल प्रणाली को प्रदर्शित करता है, जैसा कि पहले चक्रवर्ती एट अल द्वारा वर्णित किया गया है। बाह्य मैट्रिक्स (3 डी संस्कृतियों) पर उगाई जाने वाली स्तन उपकला कोशिकाएं ध्रुवीकृत विकास-गिरफ्तार स्फेरॉइड बनाती हैं। इन्हें एसिनी कहा जाता है और विवो15 में स्तन ग्रंथि की सबसे छोटी कार्यात्मक इकाई स्तन ऊतक के एसिनी से मिलता-जुलता है। इन स्फेरॉइड (चित्रा 1 ए, बी) में एक खोखले लुमेन के आसपास बारीकी से पैक ध्रुवीकृत उपकला कोशिकाओं का एक मोनोलेयर होता है और तहखाने झिल्ली (चित्रा 1 सी) से जुड़ा होता है। मॉर्फोजेनेसिस की इस प्रक्रिया को साहित्य16 में अच्छी तरह से वर्णित किया गया है। जब एलआरईसीएम पर वरीयता प्राप्त होती है, तो कोशिकाएं कोशिकाओं का एक समूह बनाने के लिए विभाजन और भेदभाव से गुजरती हैं, जो तब दिन 4 से ध्रुवीकरण करती हैं। दिन 8 तक, एसिनी में ध्रुवीकृत कोशिकाओं का एक समूह होता है जो बाह्य मैट्रिक्स के सीधे संपर्क में होते हैं और बाहरी ध्रुवीकृत कोशिकाओं के भीतर संलग्न अध्रुवीकृत कोशिकाओं का एक समूह होता है, जिसमें मैट्रिक्स से कोई संपर्क नहीं होता है। इन अध्रुवीकृत कोशिकाओं को संस्कृति के दिन 12 तक एपोप्टोसिस से गुजरने के लिए जाना जाता है, जिससे एक खोखला लुमेन बनता है। दिन 16 तक, विकास-गिरफ्तार संरचनाएं16 बनती हैं।
चित्रा 1: एसीनी में कोशिकाओं के नाभिक एक परमाणु दाग के साथ दाग. (ए) एसिनी का 3 डी निर्माण। (बी) 20 दिनों के लिए मैट्रिगेल पर उगाए गए एमसीएफ 10 ए एसिनी की चरण विपरीत छवि। (सी) केंद्र का सबसे महत्वपूर्ण खंड एक खोखले लुमेन की उपस्थिति को दर्शाता है। स्केल बार = 20 μm. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
2 डी संस्कृतियों के विपरीत, एसिनार संस्कृतियां स्पष्ट आकृति विज्ञान परिवर्तनों के माध्यम से सामान्य और परिवर्तित कोशिकाओं को अलग करने में सहायता करती हैं। गैर-रूपांतरित स्तन उपकला कोशिकाएं एक खोखले लुमेन के साथ एसिनी बनाती हैं, जो सामान्य मानव स्तन एसिनी की नकल करती हैं। ये स्फेरॉइड, परिवर्तन पर, ध्रुवीयता (कैंसर की पहचान में से एक), लुमेन की अनुपस्थिति, या खोखले लुमेन के विघटन (एपोप्टोसिस की चोरी के कारण) के एक बड़े नुकसान की विशेषता वाली एक बाधित आकृति विज्ञान दिखाते हैं जो विभिन्न जीनों के विनियमन के कारण प्रेरित हो सकता है 17,18,19,20 . इन परिवर्तनों का अध्ययन आमतौर पर इस्तेमाल की जाने वाली तकनीकों जैसे इम्यूनोफ्लोरेसेंस का उपयोग करके किया जा सकता है। इस प्रकार, 3 डी सेल संस्कृति मॉडल स्तन एसिनार मॉर्फोजेनेसिस और स्तन कार्सिनोजेनेसिस की प्रक्रिया की जांच करने के लिए एक सरल विधि के रूप में कार्य कर सकता है। फॉस्फोलिपिड मध्यस्थ, पीएएफ के प्रभाव को समझने के लिए एक 3 डी संस्कृति प्रणाली की स्थापना, उच्च थ्रूपुट प्रीक्लिनिकल ड्रग स्क्रीनिंग में सहायता करेगी।
इस काम ने पीएएफ 22 द्वारा प्रेरित परिवर्तन का अध्ययन करने के लिए 3 डी ‘ऑन टॉप’ संस्कृति प्रोटोकॉल 16,21 को अनुकूलित किया है। फॉस्फोलिपिड मध्यस्थ के लिए एसिनी के संपर्क से प्रेरित फेनोटाइपिक परिवर्तनों का अध्ययन इम्यूनोफ्लोरेसेंस का उपयोग करके किया गया था। अध्ययन में मेसेनकाइमल संक्रमण (ईएमटी) मार्करों12,16 के लिए विभिन्न ध्रुवीयता और उपकला का उपयोग किया गया था। तालिका 1 में परिवर्तन पर उनके सामान्य स्थानीयकरण और उनके अपेक्षित फेनोटाइप का उल्लेख है।
| एंटीबॉडी | चिह्न | सामान्य स्थानीयकरण | रूपांतरित फेनोटाइप |
| α6-एकीकृत | बेसोलेटरल | कमजोर पार्श्व दाग के साथ बेसल | मजबूत पार्श्व / एपिकल दाग |
| β-कैटेनिन | सेल-सेल जंक्शन | बेसोलेटरल | परमाणु या साइटोप्लाज्मिक स्थानीयकरण |
| विमेंटिन | ईएमटी | अनुपस्थित / कमजोर उपस्थिति | अप-रेगुलेशन |
तालिका 1: अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले मार्कर। पीएएफ उपचार की उपस्थिति और अनुपस्थिति में उनके स्थानीयकरण के साथ उपयोग किए जाने वाले विभिन्न मार्कर।
इस पद्धति का उपयोग प्रशंसनीय दवाओं का अध्ययन / स्क्रीन करने और विभिन्न स्तन कैंसर उपप्रकारों के लिए जीन को लक्षित करने के लिए किया जा सकता है। यह विवो परिदृश्य के करीब एक दवा प्रतिक्रिया डेटा प्रदान कर सकता है, जो तेजी से और अधिक विश्वसनीय दवा विकास में सहायता करता है। इसके अलावा, इस प्रणाली का उपयोग दवा प्रतिक्रिया और दवा प्रतिरोध से जुड़े आणविक सिग्नलिंग का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
कार्सिनोजेनेसिस की प्रक्रिया का अध्ययन करने के लिए स्थापित सेल लाइन-आधारित मॉडल का व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है। कोशिकाओं की मोनोलेयर संस्कृतियां विभिन्न आणविक सिग्नलिंग मार्गों में अंतर्दृष्?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम उपकरण और बुनियादी ढांचे तक पहुंच और प्रयोगों के लिए समर्थन के लिए आईआईएसईआर पुणे माइक्रोस्कोपी सुविधा को धन्यवाद देते हैं। इस अध्ययन को जैव प्रौद्योगिकी विभाग (डीबीटी), भारत सरकार (बीटी / पीआर 8699 / एमईडी / 30/1018/2013), विज्ञान और इंजीनियरिंग अनुसंधान बोर्ड (एसईआरबी), भारत सरकार (ईएमआर / 2016/001974) और आंशिक रूप से आईआईएसईआर, पुणे कोर फंडिंग द्वारा अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था। एके को सीएसआईआर-एसआरएफ फैलोशिप द्वारा वित्त पोषित किया गया था, एलए को डीएसटी-इंस्पायर फैलोशिप के माध्यम से वित्त पोषित किया गया था, वीसी को डीबीटी (बीटी / पीआर 8699 / एमईडी / 30/1018/2013) द्वारा वित्त पोषित किया गया था।
Materials
| 0.05% Trypsin EDTA | Invitrogen | 25300062 | |
| 16% paraformaldehyde | Alfa Aesar | AA433689M | |
| Anti Mouse Alexa Flour 488 | Invitrogen | A11029 | |
| Anti Rabbit Alexa Flour 488 | Invitrogen | A-11008 | |
| BSA | Sigma | A7030 | |
| Chamber Coverglass | Nunc | 155409 | |
| Cholera Toxin | Sigma | C8052-1MG | 1 mg/mL in dH2O |
| Confocal Microscope | Leica | Leica SP8 | |
| DMEM | Gibco | 11965126 | |
| EDTA | Sigma | E6758 | |
| EGF | Sigma | E9644-0.2MG | 100 mg/mL in dH2O |
| F(ab’)2 fragment of antibody raised in goat against mouse antigen | Jackson Immunoresearch | 115-006-006 | |
| GM130 antibody | Abcam | ab52649 | |
| Goat Serum | Abcam | ab7481 | |
| Hoechst | Invitrogen | 33258 | |
| Horse Serum | Gibco | 16050122 | |
| Hydrocortisone | Sigma | H0888 | 1 mg/mL in ethanol |
| Image Processing Software | ImageJ | ||
| Insulin | Sigma | I1882 | 10 mg/mL stock dH2O |
| lrECM (Matrigel) | Corning | 356231 | |
| Mounting reagent (Slow fade Gold Anti-fade) | Invitrogen | S36937 | |
| Nuclear Stain (Hoechst) | Invitrogen | 33258 | |
| PAF | Cayman Chemicals | 91575-58-5 | Methylcarbamyl PAF C-16, procured as a 10 mg/mL in ethanol |
| Penicillin-Streptomycin | Lonza | 17-602E | |
| Sodium Azide | Sigma | S2002 | |
| Tris Base | Sigma | B9754 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma | P9416 | |
| Vimentin antibody | Abcam | ab92547 | |
| α6-integrin antibody | Millipore | MAB1378 |
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