Mediadora fosfolipídida induzida transformação em culturas tridimensionais

Summary

O presente protocolo descreve a criação de culturas 3D ‘no topo’ de uma linha celular epitelial de mama não transformada, MCF10A, que foi modificada para estudar a transformação induzida pelo Fator de Ativação de Plaquetas (PAF). A imuno-fluorescência tem sido usada para avaliar a transformação e é discutida em detalhes.

Abstract

Vários modelos foram desenvolvidos para estudar o câncer, como modelos de roedores e linhas celulares estabelecidas. Insights valiosos sobre carcinogênese foram fornecidos por estudos que utilizam esses modelos. As linhas celulares têm proporcionado uma compreensão da desregulamentação da sinalização molecular associada à tumorigênese mamária, enquanto modelos de roedores são amplamente utilizados para estudar características celulares e moleculares do câncer de mama in vivo. O estabelecimento de culturas 3D de células epiteliais e cancerosas mamárias auxilia na ponte entre modelos in vivo e in vitro , imitando as condições in vivo in vitro. Este modelo pode ser usado para entender a desregulamentação de eventos complexos de sinalização molecular e as características celulares durante a carcinogênese mamária. Aqui, um sistema de cultura 3D é modificado para estudar uma transformação induzida por mediadores fosfolipídides (Fator de Ativação de Plaquetas, PAF). Os imunomoduladores e outras moléculas secretadas desempenham um papel importante na iniciação e progressão do tumor na mama. No presente estudo, culturas acinadoras 3D de células epiteliais mamárias são expostas a características de transformação expostas ao PAF, como perda de polaridade e características celulares alteradas. Este sistema de cultura 3D ajudará a lançar luz sobre perturbações genéticas e/ou epigenéticas induzidas por várias pequenas entidades de moléculas no microambiente tumoral. Além disso, este sistema também fornecerá uma plataforma para a identificação de novos, bem como genes conhecidos que podem estar envolvidos no processo de transformação.

Introduction

Uma miríade de modelos estão disponíveis para estudar a progressão do câncer, sendo cada um deles único e representando um subtipo dessa doença complexa. Cada modelo fornece insights únicos e valiosos sobre a biologia do câncer e melhorou os meios para imitar a condição real da doença. Linhas celulares estabelecidas cultivadas como monocamadas forneceram insights valiosos sobre processos vitais in vitro, como proliferação, invasividade, migração e apoptose¹. Embora a cultura celular bidimensional (2D) tenha sido a ferramenta tradicional para investigar a resposta das células mamíferas a várias perturbações ambientais, a extrapolação desses achados para prever respostas em nível tecidual não parece suficientemente convincente. A maior limitação das culturas 2D é que o microambiente criado difere em grande parte do do próprio tecido mamário². A cultura 2D carece da interação das células com a matriz extracelular, que é vital para o crescimento de qualquer tecido. Além disso, as forças de tração experimentadas pela célula nas culturas de monocamadas dificultam a polaridade dessas células, alterando assim a sinalização celular e o comportamento ^3,4,5. Sistemas de cultura tridimensionais (3D) abriram uma nova avenida no campo da pesquisa sobre câncer com sua capacidade de imitar as condições in vivo in vitro. Muitas pistas microambientais cruciais que são perdidas na cultura celular 2D poderiam ser restabelecidas usando culturas 3D de matriz extracelular rica em laminino (lrECM)⁶.

Vários estudos identificaram a importância do microambiente tumoral na carcinogênese ^7,8. Fatores associados à inflamação são uma parte importante do microambiente. O Fator de Ativação de Plaquetas (PAF) é um mediador fosfolipídide secretado por várias células imunes que media múltiplas respostas imunes ^9,10. Altos níveis de PAF são secretados por diferentes linhas de células cancerígenas de mama e estão associados à maior proliferação¹¹. Estudos do nosso laboratório mostraram que a presença prolongada de PAF em culturas acinar leva à transformação das células epiteliais^{mamárias 12}. O PAF ativa o receptor PAF (PAFR), ativando o eixo de sinalização PI3K/Akt¹³. O PAFR também está associado ao EMT, invasão e metástase¹⁴.

O presente protocolo demonstra um sistema modelo para estudar a transformação induzida pelo PAF, utilizando culturas 3D de células epiteliais mamárias, como foi descrito anteriormente por Chakravarty et ^al.12. As células epiteliais mamárias cultivadas na matriz extracelular (culturas 3D) tendem a formar esferoides polarizados presos pelo crescimento. Estes são chamados de acini e se assemelham muito ao acini do tecido mamário, a menor unidade funcional da glândula mamária, in vivo¹⁵. Estes esferoides (Figura 1A,B) consistem em uma monocamada de células epiteliais polarizadas estreitamente embaladas em torno de um lúmen oco e anexadas à membrana do porão (Figura 1C). Este processo de morfogênese foi bem descrito na literatura¹⁶. Quando semeadas no LrECM, as células passam por divisão e diferenciação para formar um aglomerado de células, que então polarizam a partir do dia 4. Até o dia 8, o acini consiste em um grupo de células polarizadas que estão em contato direto com a matriz extracelular e um aglomerado de células não polarizadas dentro das células externas polarizadas, sem contato com a matriz. Essas células não polidas são conhecidas por serem submetidas à apoptose até o dia 12 da cultura, formando um lúmen oco. Até o dia 16, as estruturas presas pelo crescimento são formadas^{em 16}.

Figura 1: Núcleos de células em acini manchadas com uma mancha nuclear. (A) construção 3D do acini. (B) Imagem de contraste de fase do acini MCF10A cultivada em Matrigel por 20 dias. (C) A seção mais central mostra a presença de um lúmen oco. Barra de escala = 20 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Ao contrário das culturas 2D, as culturas acinar ajudam a distinguir células normais e transformadas através de mudanças aparentes de morfologia. Células epiteliais de mama não transformadas formam acini com um lúmen oco, imitando o acini mamário humano normal. Esses esferoides, após a transformação, mostram uma morfologia interrompida caracterizada por uma grande perda de polaridade (uma das marcas do câncer), ausência de lúmen, ou interrupção do lúmen oco (devido à evasão da apoptose) que pode ser induzida devido à desregulamentação de vários genes 17,18,19,20 . Essas transformações podem ser estudadas utilizando técnicas comumente utilizadas, como a imunofluorescência. Assim, o modelo de cultura celular 3D pode funcionar como um método simples para investigar o processo de morfogênese acinar mama e carcinogênese mamária. A criação de um sistema de cultura 3D para entender o efeito de um mediador fosfolipídico, PAF, ajudará na triagem de medicamentos pré-clínicos de alto rendimento.

Este trabalho adaptou o protocolo de cultura 3D ‘no topo’^16,21 para estudar a transformação induzida pelo PAF²². As alterações fenotípicas induzidas pela exposição do acini ao mediador fosfolipídico foram estudadas por meio da imunofluorescência. ^Vários marcadores de polaridade e epitelial para transição mesenquimal (EMT)^foram utilizados no estudo. A Tabela 1 menciona sua localização normal e seu fenótipo esperado após a transformação.

Anticorpos	Marcas	Localização normal	Fenótipo transformado
α6-Integrin	Basolateral	Basal com mancha lateral fraca	Mancha lateral forte / Apical
β-Catenin	Junção celular	Basolateral	Localização anormal / nuclear ou citoplasmática
Vimentina	Emt	Presença ausente/fraca	Up-regulation

Tabela 1: Marcadores utilizados no estudo. Diferentes marcadores utilizados com sua localização na presença e ausência de tratamento paf.

Este método pode ser melhor utilizado para estudar/testar drogas plausíveis e genes-alvo para vários subtipos de câncer de mama. Isso pode fornecer um dado de resposta a medicamentos mais próximo do cenário in vivo , auxiliando no desenvolvimento mais rápido e confiável de medicamentos. Além disso, este sistema pode ser usado para estudar a sinalização molecular associada à resposta a drogas e resistência a drogas.

Protocol

1. Semeando células MCF10A em lrECM Manter as células MCF10A (células epiteliais mamárias aderentes) no meio de crescimento. Passagem pelas celas a cada 4 dias.NOTA: Composição do meio de crescimento: DMEM de alta glicose sem piruvato de sódio contendo soro de cavalo (5%), insulina (10 μg/mL), hidrocortisona (0,5 μg/mL), fator de crescimento epidérmico, EGF (20 ng/mL), de toxina de cólera (100 ng/mL) e penicilina-estreptomicina (100 unidades/mL) (ver Tabela de Materiais</…

Representative Results

As células MCF10A, após a exposição ao tratamento de PAF, formam estruturas acinar com fenótipos muito distintos. α6-integrin foi encontrado como deslocalizado com manchas mais apical. Alguns acini também mostraram manchas descontínuas (Figura 2A). Ambos os fenótipos indicam a perda da polaridade basal, evidenciada pela literatura24,25. Relatórios anteriores indicam o controverso papel do α6-integrin na metástase do cânc…

Discussion

Modelos baseados em linhas celulares estabelecidos são amplamente utilizados para estudar o processo de carcinogênese. As culturas monocamadas das células continuam a fornecer insights sobre as várias vias de sinalização molecular que mediam mudanças características nas células^{cancerosas 32}. Estudos sobre o papel de oncogenes conhecidos como Ras, Myc e p53 mutado foram relatados pela primeira vez usando culturas monocamadas como o sistema modelo 33,34,35,36.^</…

Materials

0.05% Trypsin EDTA	Invitrogen	25300062
16% paraformaldehyde	Alfa Aesar	AA433689M
Anti Mouse Alexa Flour 488	Invitrogen	A11029
Anti Rabbit Alexa Flour 488	Invitrogen	A-11008
BSA	Sigma	A7030
Chamber Coverglass	Nunc	155409
Cholera Toxin	Sigma	C8052-1MG	1 mg/mL in dH2O
Confocal Microscope	Leica	Leica SP8
DMEM	Gibco	11965126
EDTA	Sigma	E6758
EGF	Sigma	E9644-0.2MG	100 mg/mL in dH2O
F(ab’)2 fragment of antibody raised in goat against mouse antigen	Jackson Immunoresearch	115-006-006
GM130 antibody	Abcam	ab52649
Goat Serum	Abcam	ab7481
Hoechst	Invitrogen	33258
Horse Serum	Gibco	16050122
Hydrocortisone	Sigma	H0888	1 mg/mL in ethanol
Image Processing Software	ImageJ
Insulin	Sigma	I1882	10 mg/mL stock dH2O
lrECM (Matrigel)	Corning	356231
Mounting reagent (Slow fade Gold Anti-fade)	Invitrogen	S36937
Nuclear Stain  (Hoechst)	Invitrogen	33258
PAF	Cayman Chemicals	91575-58-5	Methylcarbamyl PAF C-16, procured as a 10 mg/mL in ethanol
Penicillin-Streptomycin	Lonza	17-602E
Sodium Azide	Sigma	S2002
Tris Base	Sigma	B9754
Triton X-100	Sigma	T8787
Tween 20	Sigma	P9416
Vimentin antibody	Abcam	ab92547
α6-integrin antibody	Millipore	MAB1378