Fosfolipidmediatörinducerad transformation i tredimensionella kulturer

Summary

Detta protokoll beskriver upprättandet av 3D “på toppen “ -kulturer av en icke-transformerad bröstepitelcelllinje, MCF10A, som har modifierats för att studera trombocytaktiveringsfaktor (PAF) inducerad transformation. Immunofluorescens har använts för att bedöma transformationen och diskuteras i detalj.

Abstract

Flera modeller har utvecklats för att studera cancer, till exempel gnagarmodeller och etablerade cellinjer. Värdefulla insikter om cancerframkallande ämnen har getts genom studier med hjälp av dessa modeller. Cellinjer har gett en förståelse för avregleringen av molekylär signalering i samband med brösttumörigenes, medan gnagarmodeller används i stor utsträckning för att studera cellulära och molekylära egenskaper hos bröstcancer in vivo. Upprättandet av 3D-kulturer av bröstepitel- och cancerceller hjälper till att överbrygga klyftan mellan in vivo- och in vitro-modeller genom att efterlikna in vivo-förhållandena in vitro. Denna modell kan användas för att förstå avregleringen av komplexa molekylära signalhändelser och de cellulära egenskaperna under bröstcancer. Här modifieras ett 3D-odlingssystem för att studera en fosfolipidmediatorinducerad (trombocytaktiveringsfaktor, PAF) transformation. Immunmodulatorer och andra utsöndrade molekyler spelar en viktig roll i tumörinitiering och progression i bröstet. I den aktuella studien utsätts 3D-acinarkulturer av bröstepitelceller för PAF uppvisade transformationsegenskaper såsom förlust av polaritet och förändrade cellulära egenskaper. Detta 3D-odlingssystem kommer att hjälpa till att belysa genetiska och / eller epigenetiska störningar inducerade av olika småmolekylära enheter i tumörmikromiljön. Dessutom kommer detta system också att tillhandahålla en plattform för identifiering av nya såväl som kända gener som kan vara involverade i omvandlingsprocessen.

Introduction

En myriad av modeller finns tillgängliga för att studera utvecklingen av cancer, var och en av dem är unik och representerar en subtyp av denna komplexa sjukdom. Varje modell ger unika och värdefulla insikter i cancerbiologi och har förbättrat medlen för att efterlikna det faktiska sjukdomstillståndet. Etablerade cellinjer som odlas som ett monolager har gett värdefulla insikter i viktiga processer in vitro, såsom spridning, invasivitet, migration och apoptos¹. Även om tvådimensionell (2D) cellodling har varit det traditionella verktyget för att undersöka däggdjurscellernas svar på flera miljöstörningar, verkar extrapolering av dessa fynd för att förutsäga vävnadsnivåsvar inte tillräckligt övertygande. Den största begränsningen av 2D-kulturerna är att den skapade mikromiljön skiljer sig till stor del från bröstvävnaden i sig². 2D-kulturen saknar interaktionen mellan cellerna och den extracellulära matrisen, vilket är avgörande för tillväxten av vilken vävnad som helst. Dragkrafter som upplevs av cellen i monolagerkulturer hindrar också polariteten hos dessa celler, vilket förändrar cellsignalering och beteende ^3,4,5. Tredimensionella (3D) odlingssystem har öppnat en ny väg inom cancerforskningen med sin förmåga att efterlikna in vivo-förhållandena in vitro. Många viktiga mikromiljösignaler som går förlorade i 2D-cellodling kan återupprättas med hjälp av 3D-kulturer av lamininrik extracellulär matris (lrECM)⁶.

Olika studier har identifierat betydelsen av tumörmikromiljön vid cancerframkallande ^7,8. Inflammationsassocierade faktorer är en stor del av mikromiljön. Trombocytaktiveringsfaktor (PAF) är en fosfolipidmediator som utsöndras av olika immunceller som förmedlar flera immunsvar ^9,10. Höga nivåer av PAF utsöndras av olika bröstcancercellinjer och är förknippade med förbättrad proliferation¹¹. Studier från vårt laboratorium har visat att den långvariga närvaron av PAF i acinarkulturer leder till omvandling av bröstepitelceller¹². PAF aktiverar PAF-receptorn (PAFR) och aktiverar PI3K/Akt-signalaxeln¹³. PAFR rapporteras också vara associerad med EMT, invasion och metastasering¹⁴.

Detta protokoll visar ett modellsystem för att studera PAF-inducerad transformation, med hjälp av 3D-kulturer av bröstepitelceller, som tidigare har beskrivits av Chakravarty et ^al.12. Bröstepitelcellerna som odlas på den extracellulära matrisen (3D-kulturer) tenderar att bilda polariserade tillväxtarresterade sfäroider. Dessa kallas acini och liknar acini i bröstvävnad, den minsta funktionella enheten i bröstkörteln, in vivo¹⁵. Dessa sfäroider (figur 1A,B) består av ett monolager av tätt packade polariserade epitelceller som omger en ihålig lumen och är fästa vid källarmembranet (figur 1C). Denna process av morfogenes har beskrivits väl i litteratur¹⁶. När de seedas på lrECM genomgår cellerna delning och differentiering för att bilda ett kluster av celler, som sedan polariseras från dag 4 och framåt. Vid dag 8 består acini av en grupp polariserade celler som är i direkt kontakt med den extracellulära matrisen och ett kluster av opolariserade celler inneslutna i de yttre polariserade cellerna, utan kontakt med matrisen. Dessa opolariserade celler är kända för att genomgå apoptos vid dag 12 av kulturen och bildar en ihålig lumen. Vid dag 16 bildas tillväxtarresterade strukturer¹⁶.

Figur 1: Kärnor av celler i acini färgade med en kärnfläck . (A) 3D-konstruktion av acini. (B) Faskontrastbild av MCF10A acini odlad på Matrigel i 20 dagar. (C) Den mittersta sektionen visar närvaron av en ihålig lumen. Skalstreck = 20 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Till skillnad från 2D-kulturer hjälper acinarkulturer att skilja normala och transformerade celler genom uppenbara morfologiska förändringar. Icke-transformerade bröstepitelceller bildar acini med en ihålig lumen som efterliknar den normala mänskliga bröstacini. Dessa sfäroider, vid transformation, visar en störd morfologi som kännetecknas av en stor förlust av polaritet (ett av kännetecknen för cancer), frånvaro av lumen eller störning av den ihåliga lumen (på grund av undvikande av apoptos) som kan induceras på grund av avreglering av olika gener^17,18,19,20 . Dessa transformationer kan studeras med hjälp av vanliga tekniker såsom immunofluorescens. Således kan 3D-cellodlingsmodellen fungera som en enkel metod för att undersöka processen för bröstacinarmorfogenes och bröstcancer. Att etablera ett 3D-odlingssystem för att förstå effekten av en fosfolipidmediator, PAF, kommer att hjälpa till med preklinisk läkemedelsscreening med hög genomströmning.

Detta arbete har anpassat 3D ‘on top’ kulturprotokoll^16,21 för att studera transformation inducerad av PAF ²². De fenotypiska förändringarna som inducerades av exponering av acini för fosfolipidmediatorn studerades med användning av immunofluorescens. Olika markörer för polaritet och epitelial till mesenkymal övergång (EMT)^12,16 användes i studien. Tabell 1 nämner deras normala lokalisering och deras förväntade fenotyp vid transformation.

Antikroppar	Markerar	Normal lokalisering	Transformerad fenotyp
α6-Integrin	Basolateral	Basal med svag lateral fläck	Stark lateral / apikal fläck
β-Catenin	Korsning mellan cell och cell	Basolateral	Onormal / nukleär eller cytoplasmatisk lokalisering
Vimentin	Emt	Frånvarande / svag närvaro	Uppreglering

Tabell 1: Markörer som använts i studien. Olika markörer som används med deras lokalisering i närvaro och frånvaro av PAF-behandling.

Denna metod kan bäst användas för att studera / screena troliga läkemedel och målgener för olika bröstcancerundertyper. Detta kan ge en läkemedelsresponsdata närmare in vivo-scenariot , vilket hjälper till med snabbare och mer tillförlitlig läkemedelsutveckling. Detta system kan också användas för att studera molekylär signalering associerad med läkemedelssvar och läkemedelsresistens.

Protocol

1. Såning av MCF10A-celler i lrECM Behåll MCF10A-celler (vidhäftande bröstepitelceller) i tillväxtmediet. Passera cellerna var 4: e dag.OBS: Sammansättning av tillväxtmedium: DMEM med hög glukos utan natriumpyruvat innehållande hästserum (5%), insulin (10 μg / ml), hydrokortison (0,5 μg / ml), epidermal tillväxtfaktor, EGF (20 ng / ml), koleratoxin (100 ng / ml) och penicillin-streptomycin (100 enheter / ml) (se materialtabell). Tina lrECM (se <strong…

Representative Results

MCF10A-celler, vid exponering för PAF-behandling, bildar acinarstrukturer med mycket distinkta fenotyper. α6-integrin visade sig vara fellokaliserat med mer apikal färgning. Några acini visade också diskontinuerlig färgning (figur 2A). Båda dessa fenotyper indikerar förlusten av basal polaritet, vilket framgår av litteraturen24,25. Tidigare rapporter indikerar den kontroversiella rollen av α6-integrin i cancermetastaser. α…

Discussion

Etablerade cellinjebaserade modeller används ofta för att studera processen för cancerframkallande. Monolagerkulturer av celler fortsätter att ge insikter i de olika molekylära signalvägarna som förmedlar karakteristiska förändringar i cancerceller³². Studier av rollen av välkända onkogener som Ras, Myc och muterad p53 rapporterades först med monolagerkulturer som modellsystem^{33,34,35,36<…}

Materials

0.05% Trypsin EDTA	Invitrogen	25300062
16% paraformaldehyde	Alfa Aesar	AA433689M
Anti Mouse Alexa Flour 488	Invitrogen	A11029
Anti Rabbit Alexa Flour 488	Invitrogen	A-11008
BSA	Sigma	A7030
Chamber Coverglass	Nunc	155409
Cholera Toxin	Sigma	C8052-1MG	1 mg/mL in dH2O
Confocal Microscope	Leica	Leica SP8
DMEM	Gibco	11965126
EDTA	Sigma	E6758
EGF	Sigma	E9644-0.2MG	100 mg/mL in dH2O
F(ab’)2 fragment of antibody raised in goat against mouse antigen	Jackson Immunoresearch	115-006-006
GM130 antibody	Abcam	ab52649
Goat Serum	Abcam	ab7481
Hoechst	Invitrogen	33258
Horse Serum	Gibco	16050122
Hydrocortisone	Sigma	H0888	1 mg/mL in ethanol
Image Processing Software	ImageJ
Insulin	Sigma	I1882	10 mg/mL stock dH2O
lrECM (Matrigel)	Corning	356231
Mounting reagent (Slow fade Gold Anti-fade)	Invitrogen	S36937
Nuclear Stain  (Hoechst)	Invitrogen	33258
PAF	Cayman Chemicals	91575-58-5	Methylcarbamyl PAF C-16, procured as a 10 mg/mL in ethanol
Penicillin-Streptomycin	Lonza	17-602E
Sodium Azide	Sigma	S2002
Tris Base	Sigma	B9754
Triton X-100	Sigma	T8787
Tween 20	Sigma	P9416
Vimentin antibody	Abcam	ab92547
α6-integrin antibody	Millipore	MAB1378