Protokoller for CRISPR/Cas9 Mutagenese af den orientalske bananflue Bactrocera dorsalis
Summary
Dette papir præsenterer de trinvise protokoller for CRISPR / Cas9 mutagenese af den orientalske frugtflue Bactrocera dorsalis. Detaljerede trin fra denne standardiserede protokol vil tjene som en nyttig vejledning til generering af mutantfluer til funktionelle genstudier i B. dorsalis.
Abstract
Den orientalske bananflue, Bactrocera dorsalis, er en meget invasiv og adaptiv skadedyrsart, der forårsager skade på citrus og over 150 andre frugtafgrøder verden over. Da voksne frugtfluer har stor flyvekapacitet, og kvinder lægger deres æg under frugtskindene, fungerer insekticider, der kræver direkte kontakt med skadedyret, normalt dårligt i marken. Med udviklingen af molekylærbiologiske værktøjer og high-throughput sekventeringsteknologi forsøger mange forskere at udvikle miljøvenlige skadedyrsbekæmpelsesstrategier. Disse omfatter RNAi eller genredigeringsbaserede pesticider, der nedregulerer eller tavser gener (molekylære mål), såsom olfaktoriske gener involveret i søgeadfærd, i forskellige skadedyr. For at tilpasse disse strategier til orientalsk bananfluekontrol er der behov for effektive metoder til funktionel genforskning. Gener med kritiske funktioner i overlevelse og reproduktion af B. dorsalis tjener som gode molekylære mål for gennedslag og / eller hæmning. CRISPR/Cas9-systemet er en pålidelig teknik, der anvendes til genredigering, især i insekter. Dette papir præsenterer en systematisk metode til CRISPR / Cas9 mutagenese af B. dorsalis, herunder design og syntese af guide RNA’er, indsamling af embryoner, embryoinjektion, insektopdræt og mutant screening. Disse protokoller vil tjene som en nyttig vejledning til generering af mutantfluer for forskere, der er interesseret i funktionelle genstudier i B. dorsalis.
Introduction
Den orientalske frugtflue, Bactrocera dorsalis , er en kosmopolitisk insektskadedyrsart, der forårsager skade på over 150 arter af frugtafgrøder, herunder guava, mango, Eugenia spp., Surinam kirsebær, citrus, loquat og papaya1. Skaden forårsaget i Guangdong-provinsen (Kina) alene anslås til over 200 millioner yuans. Voksne kvinder indsætter deres æg under huden af modne eller modne frugter, hvilket forårsager forfald og abscission af frugten, hvilket reducerer frugtkvaliteten og det samlede udbytte af afgrøden2. Da voksne bananfluer har stor flyvekapacitet, og deres larver borede sig ind i frugthuden, fungerer insekticider, der kræver direkte kontakt med skadedyret, dårligt i marken. Derudover har den omfattende anvendelse af insekticider øget B. dorsalis resistens over for forskellige landbrugskemikalier, hvilket gør bekæmpelsen af disse skadelige skadedyr endnu vanskeligere3. Derfor er der desperat behov for udvikling af effektive og miljøvenlige skadedyrsbekæmpelsesstrategier.
For nylig, med udviklingen af molekylærbiologiske værktøjer og high-throughput sekventeringsteknologier, forsøger forskere at udvikle miljøvenlige skadedyrsbekæmpelsesstrategier, såsom RNAi, der er målrettet mod funktionaliteten af vigtige gener (molekylære mål) for forskellige skadedyr. Gener, der er kritiske for skadegørerens overlevelse og reproduktion, kan identificeres gennem funktionelle genundersøgelser og tjener yderligere som potentielle molekylære mål for forbedring af specifikt målrettede og miljøvenlige skadedyrsbekæmpelsesværktøjer4. For at tilpasse sådanne strategier til orientalsk bananfluekontrol er der behov for effektive metoder til funktionel genforskning.
CRISPR/Cas (grupperet regelmæssigt interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associeret) endonukleasesystem blev oprindeligt opdaget i bakterier og arkæer og viste sig at være en adaptiv mekanisme involveret i genkendelse og nedbrydning af fremmed intracellulært DNA, såsom det, der blev introduceret ved at inficere bakteriofager5. I type II CRISPR-systemet styres Cas9-endonuklease af små associerede RNA’er (crRNA og tracrRNA) for at spalte indtrængende DNA 6,7,8 og er blevet et af de mest anvendte værktøjer til genredigering til dato9,10,11,12. Da CRISPR/Cas9-systemet har flere fordele, såsom høj effektivitet af genhæmning og lave omkostninger, er det allerede blevet anvendt til genredigering i forskellige insektarter, herunder Aedes aegypti13,14, Locusta migratoria15 og Bombyx mori16. I B. dorsalis er gener relateret til kropsfarve, vingedimorfisme og kønsbestemmelse med succes blevet slået ud ved hjælp af CRISPR / Cas917,18,19. Detaljerede procedurer for CRISPR/Cas9-anvendelse i dette insekt er dog stadig ufuldstændige. Desuden er nogle trin fra forskere til B. dorsalis genredigering også varierede og har brug for standardisering. For eksempel var formerne for Cas9 forskellige i offentliggjorte referencer17,18,19.
Dette papir giver en systematisk metode til mutagenese af B. dorsalis ved hjælp af CRISPR / Cas9-systemet, herunder design og syntese af guide-RNA’er, indsamling af embryoner, embryoinjektion, insektopdræt og mutantscreening. Denne protokol vil tjene som en nyttig vejledning til generering af mutantfluer for forskere, der er interesseret i de funktionelle genstudier i B. dorsalis.
Protocol
Representative Results
Discussion
CRISPR/Cas9-systemet er det mest anvendte genredigeringsværktøj og har forskellige anvendelser, såsom gen threpy30, afgrødeavl 31 og grundlæggende undersøgelser af genfuctions32. Dette system er allerede blevet anvendt til genredigering i forskellige insektarter og har fungeret som et effektivt værktøj til funktionelle genundersøgelser i skadedyr. De protokoller, vi præsenterer her, standardiserer proceduren for design og syntese af guide-R…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af Shenzhen Science and Technology Program (Grant No. KQTD20180411143628272) og særlige midler til videnskabsteknologisk innovation og industriel udvikling af Shenzhen Dapeng New District (Grant No. PT202101-02).
Materials
| 6x DNA Loading Buffer | TransGen Biotech | GH101-01 | |
| Artificial climate chamber | ShangHai BluePard | MGC-350P | |
| AxyPrep Genomic DNA Mini-Extraction Kit | Axygen | AP-MN-MS-GDNA-250G | |
| BLAT | NA | NA | For searching potential gene loci in the genome |
| Capillary Glass | WPI | 1B100F-4 | |
| Eppendorf InjectMan 4 micromanipulator | Eppendorf | InjectMan 4 | |
| GeneArt Precision gRNA Synthesis Kit | Thermo Fisher Scientific | A29377 | |
| Hisat2 | NA | NA | For aligning the transcriptome to the acquired gene loci |
| IGV | NA | NA | For visualizing the results from Transdecoder |
| Microgrinder | NARISHIGE | EG-401 | |
| Olympus Microscope | Olympus Corporation | SZ2-ILST | |
| pEASY-Blunt Cloning Kit | TransGen Biotech | CB101-02 | https://www.transgenbiotech.com/data/upload/pdf/CB101_2022-07-14.pdf |
| Phenol red solution | Sigma-Aldrich | P0290-100ML | |
| Pipette cookbook 2018 P-97 & P-1000 Micropipette Pullers | Instrument Company | https://www.sutter.com/PDFs/cookbook.pdf | |
| PrimeSTAR HS (Premix) | Takara Biomedical Technology | R040A | |
| SAMtools | NA | NA | For generating the sorted bam files |
| sgRNAcas9-AI | NA | NA | sgRNA design http://123.57.239.141:8080/home |
| Sutter Micropipette Puller Sutter | Instrument Company | P-97 | |
| Trans2K DNA Marker | TransGen Biotech | BM101-02 | |
| Transdecoder | NA | NA | For combining the results of assemble transcripts and gene loci information https://github.com/TransDecoder/TransDecoder/releases/tag/TransDecoder-v5.5.0 |
| TrueCut Cas9 Protein v2 | Thermo Fisher Scientific | A36498 | |
| Ultra-trace biological detector | Thermo Fisher Scientific | Nanodrop 2000C |
References
- Christenson, L. D., Foote, R. H. Biology of fruit flies. Annual Review of Entomology. 5 (1), 171-192 (1960).
- Ma, X., et al. The assessment of the economic losses caused by Bactrocera dorsalis, B. cucurbitae and B. tau to Guangdong province. Plant Quarantine. 27 (3), 50-56 (2013).
- Jin, M., et al. Chemical control measures and drug resistance management of Bactrocera dorsalis. Agrochemicals. 60 (1), 1-5 (2021).
- Yang, B., Liu, Y., Wang, B., Wang, G. Olfaction-based behaviorally manipulated technology of pest insects: research progress, opportunities and challenges. Bulletin of National Natural Science Foundation of China. 34 (4), 441-446 (2020).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Garneau, J. E., et al. The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA. Nature. 468 (7320), 67-71 (2010).
- Pyzocha, N. K., et al. RNA-guided genome editing of mammalian cells. Gene Correction. , 269-277 (2014).
- Weiss, D., et al. CRISPR-Cas systems: new players in gene regulation and bacterial physiology. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 4, 37 (2014).
- Doudna, J. A., Charpentier, E. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346 (6213), 1258096 (2014).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Li, D., et al. Heritable gene targeting in the mouse and rat using a CRISPR-Cas system. Nature Biotechnology. 31 (8), 681-683 (2013).
- Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153 (4), 910-918 (2013).
- Li, H., et al. Generating mutant Aedes aegypti mosquitoes using the CRISPR/Cas9 system. STAR protocols. 2 (2), 100432 (2021).
- Zhu, G. -. H., et al. Expanding the toolkit for genome editing in a disease vector, Aedes aegypti: transgenic lines expressing Cas9 and single guide RNA induce efficient mutagenesis. The CRISPR Journal. 4 (6), 846-853 (2021).
- Li, Y., et al. CRISPR/Cas9 in locusts: Successful establishment of an olfactory deficiency line by targeting the mutagenesis of an odorant receptor co-receptor (Orco). Insect Biochemistry and Molecular Biology. 79, 27-35 (2016).
- Liu, Q., et al. Deletion of the Bombyx mori odorant receptor co-receptor (BmOrco) impairs olfactory sensitivity in silkworms. Insect Biochemistry & Molecular Biology. 86, 58-67 (2017).
- Zhao, S., et al. Efficient somatic and germline genome engineering of Bactrocera dorsalis by the CRISPR/Cas9 system. Pest Management Science. 75 (7), 1921-1932 (2019).
- Bai, X., et al. CRISPR/Cas9-mediated knockout of the eye pigmentation gene white leads to alterations in colour of head spots in the oriental fruit fly, Bactrocera dorsalis. Insect Molecular Biology. 28 (6), 837-849 (2019).
- Zheng, W., et al. Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated 9-mediated mutagenesis of the multiple edematous wings gene induces muscle weakness and flightlessness in Bactrocera dorsalis (Diptera: Tephritidae). Insect Molecular Biology. 28 (2), 222-234 (2019).
- Kent, W. J. BLAT-the BLAST-like alignment tool. Genome Research. 12 (4), 656-664 (2002).
- Kim, D., Langmead, B., Salzberg, S. L. HISAT: A fast spliced aligner with low memory requirements. Nature Methods. 12 (4), 357-360 (2015).
- Danecek, P., et al. Twelve years of SAMtools and BCFtools. Gigascience. 10 (2), (2021).
- Kovaka, S., et al. Transcriptome assembly from long-read RNA-seq alignments with StringTie2. Genome Biology. 20 (1), 278 (2019).
- . TransDecoder Available from: https://github.com/TransDecoder/TransDecoder/releases/tag/TransDecoder-v5.5.0 (2018)
- Robinson, J. T., et al. Integrative genomics viewer. Nature Biotechnology. 29 (1), 24-26 (2011).
- Chang, H., et al. A pheromone antagonist regulates optimal mating time in the moth Helicoverpa armigera. Current Biology. 27 (11), 1610-1615 (2017).
- Xie, S., et al. sgRNAcas9: a software package for designing CRISPR sgRNA and evaluating potential off-target cleavage sites. PloS One. 9 (6), 100448 (2014).
- Zheng, Q. P., et al. Precise gene deletion and replacement using the CRISPR/Cas9 system in human cells. Biotechniques. 57 (3), 115-124 (2014).
- Ren, L., et al. Rectal bacteria produce sex pheromones in the male oriental fruit fly. Current Biology. 31 (10), 2220-2226 (2021).
- Xiao, Q., et al. Application of CRISPR/Cas9-based gene editing in HIV-1/AIDS therapy. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 9, 69 (2019).
- El-Mounadi, K., et al. Principles, applications, and biosafety of plant genome editing using CRISPR-Cas9. Frontiers in Plant Science. 11, 56 (2020).
- Hsu, P. D., et al. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 157 (6), 1262-1278 (2014).
- Labun, K., et al. CHOPCHOP v3: expanding the CRISPR web toolbox beyond genome editing. Nucleic Acids Research. 47, 171-174 (2019).
- Ai, D., et al. Embryo microinjection and knockout mutant identification of CRISPR/Cas9 genome-edited Helicoverpa armigera (Hübner). Journal of Visualized Experiments. (173), e62068 (2021).
- Xie, S., et al. sgRNAcas9: a software package for designing CRISPR sgRNA and evaluating potential off-target cleavage sites. PloS One. 9 (6), 100448 (2014).
- Gratz, S. J., et al. Genome engineering of Drosophila with the CRISPR RNA-guided Cas9 nuclease. Genetics. 194 (4), 1029-1035 (2013).
- Zhu, G. H., et al. Knockout of juvenile hormone receptor, Methoprene-tolerant, induces black larval phenotype in the yellow fever mosquito, Aedes aegypti. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (43), 21501-21507 (2019).
- Laohakieat, K., Isasawin, S., Thanaphum, S. The transformer-2 and fruitless characterisation with developmental expression profiles of sex-determining genes in Bactrocera dorsalis and B. correcta. Scientific Reports. 10 (1), 1-13 (2020).
- Gabrieli, P., et al. Sperm-less males modulate female behaviour in Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae). Insect Biochemistry and Molecular Biology. 79, 13-26 (2016).
