オリエンタルショウジョウバエバクトセラ背側のCRISPR/Cas9変異誘発のためのプロトコル
Summary
この論文は、オリエンタルショウジョウバエBactrocera dorsalisのCRISPR/Cas9突然変異誘発のための段階的なプロトコルを提示します。この標準化されたプロトコルによって提供される詳細な手順は、B. dorsalisの機能的遺伝子研究のための突然変異ハエを生成するための有用なガイドとして役立ちます。
Abstract
オリエンタルショウジョウバエ、 Bactrocera dorsalis は、非常に侵略的で適応性のある害虫種であり、世界中の柑橘類や150を超える他の果物作物に被害をもたらします。成虫のショウジョウバエは飛行能力が高く、雌は果実の皮の下に卵を産むため、害虫との直接接触を必要とする殺虫剤は通常、野外ではあまり機能しません。分子生物学的ツールとハイスループットシーケンシング技術の開発により、多くの科学者が環境に優しい害虫管理戦略を開発しようとしています。これらには、さまざまな害虫の探索行動に関与する嗅覚遺伝子などの遺伝子(分子標的)を下方制御またはサイレンシングするRNAiまたは遺伝子編集ベースの農薬が含まれます。これらの戦略を東洋のショウジョウバエ防除に適応させるためには、機能遺伝子研究のための効果的な方法が必要です。 B. dorsalis の生存と繁殖に重要な機能を持つ遺伝子は、遺伝子ノックダウンおよび/またはサイレンシングの優れた分子標的として機能します。CRISPR/Cas9システムは、特に昆虫の遺伝子編集に使用される信頼性の高い技術です。本論文では、 B. dorsalisのCRISPR/Cas9変異誘発のための体系的な方法を提示し、ガイドRNAの設計と合成、胚の収集、胚注入、昆虫飼育、変異体スクリーニングを含む。これらのプロトコルは、 B. dorsalisの機能遺伝子研究に関心のある研究者にとって、突然変異ハエを生成するための有用なガイドとして役立ちます。
Introduction
オリエンタルショウジョウバエ、バ クトセラ・ドルサリス は、グアバ、マンゴー、ユージニア属、スリナムチェリー、柑橘類、ビワ、パパイヤなど、150種以上の果物作物に被害を与える国際的な害虫種です1。広東省(中国)だけでも2億元以上の被害が見込まれています。成体の雌は、熟した果実または熟した果実の皮の下に卵を挿入し、果実の腐敗と脱落を引き起こし、果実の品質と作物の全体的な収量を低下させます2。成虫のショウジョウバエは飛行能力が高く、幼虫が果実の皮に穴を開けるため、害虫との直接接触を必要とする殺虫剤は野外ではあまり機能しません。さらに、殺虫剤の広範な使用により、さまざまな農薬に対する B.dorsalis の耐性が高まり、これらの有害な害虫の防除がさらに困難になっています3。したがって、効果的で環境に優しい害虫管理戦略の開発が切実に必要とされています。
近年、分子生物学的ツールやハイスループットシーケンシング技術の開発により、様々な害虫の重要な遺伝子(分子標的)の機能を対象としたRNAiなどの環境にやさしい害虫管理戦略の開発が試みられています。有害生物の生存と繁殖に重要な遺伝子は、機能遺伝子研究を通じて同定することができ、さらに、特異的に標的を絞った環境に優しい害虫管理ツールの改善のための潜在的な分子標的として役立つ可能性があります4。このような戦略を東洋のショウジョウバエ防除に適応させるためには、機能遺伝子研究のための効果的な方法が必要です。
CRISPR/Cas(クラスター化された規則的に間隔を空けた短い回文反復/CRISPR関連)エンドヌクレアーゼシステムは、細菌や古細菌で最初に発見され、バクテリオファージの感染によって導入されるような外来細胞内DNAの認識と分解に関与する適応メカニズムであることが判明しました5。II型CRISPRシステムでは、Cas9エンドヌクレアーゼは小さな関連RNA(crRNAおよびtracrRNA)によって誘導され、不法侵入DNAを切断し6,7,8、現在までに遺伝子編集に最も広く使用されているツールの1つになっています9,10,11,12。CRISPR/Cas9システムには、遺伝子サイレンシングの高効率や低コストなどのいくつかの利点があるため、ネッタイシマカ13,14、イナマカ渡り15、ボンビクスモリ16など、さまざまな昆虫種の遺伝子編集にすでに適用されています。B. dorsalisでは、CRISPR/Cas917,18,19を用いて、体色、翅二型、性決定に関する遺伝子のノックアウトに成功しています。しかし、この昆虫におけるCRISPR/Cas9の適用のための詳細な手順は不完全なままです。さらに、B. dorsalis遺伝子編集のために研究者によって提供されたいくつかのステップも多様であり、標準化が必要です。例えば、Cas9の形態は、公開された参考文献17,18,19では異なっていた。
本論文では、CRISPR/Cas9システムを用いた B. dorsalis の突然変異誘発法について、ガイドRNAの設計・合成、胚の採取、胚注入、昆虫飼育、変異体スクリーニングなど、体系的な方法を提供します。このプロトコルは、 B. dorsalisの機能的遺伝子研究に関心のある研究者にとって、突然変異ハエを生成するための有用なガイドとして役立ちます。
Protocol
Representative Results
Discussion
CRISPR/Cas9システムは、最も広く使用されている遺伝子編集ツールであり、遺伝子スレピー30、作物育種31、遺伝子機能の基礎研究32など、さまざまな用途があります。このシステムは、すでに様々な昆虫種の遺伝子編集に応用されており、害虫の機能的遺伝子研究に有効なツールとして役立っています。ここで紹介するプロトコルは、ガイ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作業は、深セン科学技術プログラム(助成金番号。 KQTD20180411143628272)および深セン大鵬新区の科学技術革新と産業開発のための特別基金(助成金番号PT202101-02)。
Materials
| 6x DNA Loading Buffer | TransGen Biotech | GH101-01 | |
| Artificial climate chamber | ShangHai BluePard | MGC-350P | |
| AxyPrep Genomic DNA Mini-Extraction Kit | Axygen | AP-MN-MS-GDNA-250G | |
| BLAT | NA | NA | For searching potential gene loci in the genome |
| Capillary Glass | WPI | 1B100F-4 | |
| Eppendorf InjectMan 4 micromanipulator | Eppendorf | InjectMan 4 | |
| GeneArt Precision gRNA Synthesis Kit | Thermo Fisher Scientific | A29377 | |
| Hisat2 | NA | NA | For aligning the transcriptome to the acquired gene loci |
| IGV | NA | NA | For visualizing the results from Transdecoder |
| Microgrinder | NARISHIGE | EG-401 | |
| Olympus Microscope | Olympus Corporation | SZ2-ILST | |
| pEASY-Blunt Cloning Kit | TransGen Biotech | CB101-02 | https://www.transgenbiotech.com/data/upload/pdf/CB101_2022-07-14.pdf |
| Phenol red solution | Sigma-Aldrich | P0290-100ML | |
| Pipette cookbook 2018 P-97 & P-1000 Micropipette Pullers | Instrument Company | https://www.sutter.com/PDFs/cookbook.pdf | |
| PrimeSTAR HS (Premix) | Takara Biomedical Technology | R040A | |
| SAMtools | NA | NA | For generating the sorted bam files |
| sgRNAcas9-AI | NA | NA | sgRNA design http://123.57.239.141:8080/home |
| Sutter Micropipette Puller Sutter | Instrument Company | P-97 | |
| Trans2K DNA Marker | TransGen Biotech | BM101-02 | |
| Transdecoder | NA | NA | For combining the results of assemble transcripts and gene loci information https://github.com/TransDecoder/TransDecoder/releases/tag/TransDecoder-v5.5.0 |
| TrueCut Cas9 Protein v2 | Thermo Fisher Scientific | A36498 | |
| Ultra-trace biological detector | Thermo Fisher Scientific | Nanodrop 2000C |
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