Protocollen voor CRISPR/Cas9 Mutagenese van de Oosterse Fruitvlieg Bactrocera dorsalis
Summary
Dit artikel presenteert de stapsgewijze protocollen voor CRISPR/Cas9-mutagenese van de Oosterse fruitvlieg Bactrocera dorsalis. Gedetailleerde stappen in dit gestandaardiseerde protocol zullen dienen als een nuttige gids voor het genereren van gemuteerde vliegen voor functionele genstudies in B. dorsalis.
Abstract
De Oosterse fruitvlieg, Bactrocera dorsalis, is een zeer invasieve en adaptieve plaagsoort die wereldwijd schade toebrengt aan citrusvruchten en meer dan 150 andere fruitgewassen. Omdat volwassen fruitvliegen een grote vliegcapaciteit hebben en vrouwtjes hun eieren onder de schil van fruit leggen, presteren insecticiden die direct contact met de plaag vereisen meestal slecht in het veld. Met de ontwikkeling van moleculair biologische hulpmiddelen en high-throughput sequencing-technologie proberen veel wetenschappers milieuvriendelijke plaagbestrijdingsstrategieën te ontwikkelen. Deze omvatten RNAi of op genbewerking gebaseerde pesticiden die genen (moleculaire doelen) downreguleren of tot zwijgen brengen, zoals olfactorische genen die betrokken zijn bij zoekgedrag, in verschillende insectenplagen. Om deze strategieën voor oosterse fruitvliegbestrijding aan te passen, zijn effectieve methoden voor functioneel genonderzoek nodig. Genen met kritische functies in de overleving en reproductie van B. dorsalis dienen als goede moleculaire doelwitten voor gen knockdown en/of silencing. Het CRISPR/Cas9-systeem is een betrouwbare techniek die wordt gebruikt voor genbewerking, vooral bij insecten. Dit artikel presenteert een systematische methode voor CRISPR/Cas9-mutagenese van B. dorsalis, inclusief het ontwerp en de synthese van gids-RNA’s, het verzamelen van embryo’s, embryo-injectie, insectenopfok en mutantscreening. Deze protocollen zullen dienen als een nuttige gids voor het genereren van gemuteerde vliegen voor onderzoekers die geïnteresseerd zijn in functionele genstudies in B. dorsalis.
Introduction
De Oosterse fruitvlieg, Bactrocera dorsalis, is een kosmopolitische insectenplaagsoort die schade toebrengt aan meer dan 150 soorten fruitgewassen, waaronder guave, mango, Eugenia spp., Surinaamse kers, citrus, loquat en papaja1. De schade die alleen al in de provincie Guangdong (China) is aangericht, wordt geschat op meer dan 200 miljoen yuan. Volwassen vrouwtjes brengen hun eieren onder de schil van rijpend of gerijpt fruit, waardoor bederf en abscissie van het fruit ontstaat, wat de vruchtkwaliteit en de algehele opbrengst van het gewas vermindert2. Omdat volwassen fruitvliegen een grote vliegcapaciteit hebben en hun larven zich in de vruchthuid boren, presteren insecticiden die direct contact met de plaag vereisen slecht in het veld. Bovendien heeft het uitgebreide gebruik van insecticiden de resistentie van B. dorsalis tegen verschillende landbouwchemicaliën verhoogd, waardoor de bestrijding van deze schadelijke plagen nog moeilijkerwordt 3. Daarom is de ontwikkeling van effectieve en milieuvriendelijke strategieën voor ongediertebestrijding hard nodig.
Onlangs, met de ontwikkeling van moleculair biologische hulpmiddelen en high-throughput sequencing-technologieën, proberen wetenschappers milieuvriendelijke plaagbestrijdingsstrategieën te ontwikkelen, zoals RNAi, die zich richten op de functionaliteit van belangrijke genen (moleculaire doelen) van verschillende insectenplagen. Genen die van cruciaal belang zijn voor de overleving en reproductie van het plaagorganisme kunnen worden geïdentificeerd door middel van functionele genstudies en dienen verder als potentiële moleculaire doelen voor de verbetering van specifiek gerichte en milieuvriendelijke plaagbestrijdingsinstrumenten4. Om dergelijke strategieën aan te passen aan oosterse fruitvliegbestrijding, zijn effectieve methoden voor functioneel genonderzoek nodig.
Het CRISPR/Cas (clustered regular interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated) endonucleasesysteem werd aanvankelijk ontdekt in bacteriën en archaea en bleek een adaptief mechanisme te zijn dat betrokken is bij de herkenning en afbraak van vreemd intracellulair DNA, zoals dat werd geïntroduceerd door bacteriofagen te infecteren5. In het type II CRISPR-systeem wordt Cas9-endonuclease geleid door kleine geassocieerde RNA’s (crRNA en tracrRNA) om 6,7,8 te breken en is het een van de meest gebruikte hulpmiddelen voor genbewerking tot nu toe geworden 9,10,11,12. Omdat het CRISPR/Cas9-systeem verschillende voordelen heeft, zoals een hoge efficiëntie van gen-uitschakeling en lage kosten, is het al toegepast voor genbewerking bij verschillende insectensoorten, waaronder Aedes aegypti13,14, Locusta migratoria15 en Bombyx mori16. In B. dorsalis zijn genen die verband houden met lichaamskleur, vleugeldimorfisme en geslachtsbepaling met succes uitgeschakeld met CRISPR / Cas9 17,18,19. Gedetailleerde procedures voor CRISPR/Cas9-toepassing in dit insect blijven echter onvolledig. Bovendien zijn sommige stappen die onderzoekers bieden voor B. dorsalis-genbewerking ook gevarieerd en hebben ze behoefte aan standaardisatie. De vormen van Cas9 waren bijvoorbeeld verschillend in gepubliceerde referenties 17,18,19.
Dit artikel biedt een systematische methode voor mutagenese van B. dorsalis met behulp van het CRISPR / Cas9-systeem, inclusief het ontwerp en de synthese van gids-RNA’s, het verzamelen van embryo’s, embryo-injectie, insectenopfok en mutantscreening. Dit protocol zal dienen als een nuttige gids voor het genereren van gemuteerde vliegen voor onderzoekers die geïnteresseerd zijn in de functionele genstudies in B. dorsalis.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het CRISPR/Cas9-systeem is de meest gebruikte genbewerkingstool en heeft verschillende toepassingen, zoals gene threpy30, crop breeding31 en basisstudies van genfuctions32. Dit systeem is al toegepast voor genbewerking bij verschillende insectensoorten en heeft gediend als een effectief hulpmiddel voor functionele genstudies bij plagen. De protocollen die we hier presenteren, standaardiseren de procedure voor het ontwerp en de synthese van gids-RNA’s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door het Shenzhen Science and Technology Program (Grant No. KQTD20180411143628272) en speciale fondsen voor innovatie op het gebied van wetenschapstechnologie en industriële ontwikkeling van Shenzhen Dapeng New District (Grant No. PT202101-02).
Materials
| 6x DNA Loading Buffer | TransGen Biotech | GH101-01 | |
| Artificial climate chamber | ShangHai BluePard | MGC-350P | |
| AxyPrep Genomic DNA Mini-Extraction Kit | Axygen | AP-MN-MS-GDNA-250G | |
| BLAT | NA | NA | For searching potential gene loci in the genome |
| Capillary Glass | WPI | 1B100F-4 | |
| Eppendorf InjectMan 4 micromanipulator | Eppendorf | InjectMan 4 | |
| GeneArt Precision gRNA Synthesis Kit | Thermo Fisher Scientific | A29377 | |
| Hisat2 | NA | NA | For aligning the transcriptome to the acquired gene loci |
| IGV | NA | NA | For visualizing the results from Transdecoder |
| Microgrinder | NARISHIGE | EG-401 | |
| Olympus Microscope | Olympus Corporation | SZ2-ILST | |
| pEASY-Blunt Cloning Kit | TransGen Biotech | CB101-02 | https://www.transgenbiotech.com/data/upload/pdf/CB101_2022-07-14.pdf |
| Phenol red solution | Sigma-Aldrich | P0290-100ML | |
| Pipette cookbook 2018 P-97 & P-1000 Micropipette Pullers | Instrument Company | https://www.sutter.com/PDFs/cookbook.pdf | |
| PrimeSTAR HS (Premix) | Takara Biomedical Technology | R040A | |
| SAMtools | NA | NA | For generating the sorted bam files |
| sgRNAcas9-AI | NA | NA | sgRNA design http://123.57.239.141:8080/home |
| Sutter Micropipette Puller Sutter | Instrument Company | P-97 | |
| Trans2K DNA Marker | TransGen Biotech | BM101-02 | |
| Transdecoder | NA | NA | For combining the results of assemble transcripts and gene loci information https://github.com/TransDecoder/TransDecoder/releases/tag/TransDecoder-v5.5.0 |
| TrueCut Cas9 Protein v2 | Thermo Fisher Scientific | A36498 | |
| Ultra-trace biological detector | Thermo Fisher Scientific | Nanodrop 2000C |
References
- Christenson, L. D., Foote, R. H. Biology of fruit flies. Annual Review of Entomology. 5 (1), 171-192 (1960).
- Ma, X., et al. The assessment of the economic losses caused by Bactrocera dorsalis, B. cucurbitae and B. tau to Guangdong province. Plant Quarantine. 27 (3), 50-56 (2013).
- Jin, M., et al. Chemical control measures and drug resistance management of Bactrocera dorsalis. Agrochemicals. 60 (1), 1-5 (2021).
- Yang, B., Liu, Y., Wang, B., Wang, G. Olfaction-based behaviorally manipulated technology of pest insects: research progress, opportunities and challenges. Bulletin of National Natural Science Foundation of China. 34 (4), 441-446 (2020).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Garneau, J. E., et al. The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA. Nature. 468 (7320), 67-71 (2010).
- Pyzocha, N. K., et al. RNA-guided genome editing of mammalian cells. Gene Correction. , 269-277 (2014).
- Weiss, D., et al. CRISPR-Cas systems: new players in gene regulation and bacterial physiology. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 4, 37 (2014).
- Doudna, J. A., Charpentier, E. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346 (6213), 1258096 (2014).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Li, D., et al. Heritable gene targeting in the mouse and rat using a CRISPR-Cas system. Nature Biotechnology. 31 (8), 681-683 (2013).
- Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153 (4), 910-918 (2013).
- Li, H., et al. Generating mutant Aedes aegypti mosquitoes using the CRISPR/Cas9 system. STAR protocols. 2 (2), 100432 (2021).
- Zhu, G. -. H., et al. Expanding the toolkit for genome editing in a disease vector, Aedes aegypti: transgenic lines expressing Cas9 and single guide RNA induce efficient mutagenesis. The CRISPR Journal. 4 (6), 846-853 (2021).
- Li, Y., et al. CRISPR/Cas9 in locusts: Successful establishment of an olfactory deficiency line by targeting the mutagenesis of an odorant receptor co-receptor (Orco). Insect Biochemistry and Molecular Biology. 79, 27-35 (2016).
- Liu, Q., et al. Deletion of the Bombyx mori odorant receptor co-receptor (BmOrco) impairs olfactory sensitivity in silkworms. Insect Biochemistry & Molecular Biology. 86, 58-67 (2017).
- Zhao, S., et al. Efficient somatic and germline genome engineering of Bactrocera dorsalis by the CRISPR/Cas9 system. Pest Management Science. 75 (7), 1921-1932 (2019).
- Bai, X., et al. CRISPR/Cas9-mediated knockout of the eye pigmentation gene white leads to alterations in colour of head spots in the oriental fruit fly, Bactrocera dorsalis. Insect Molecular Biology. 28 (6), 837-849 (2019).
- Zheng, W., et al. Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated 9-mediated mutagenesis of the multiple edematous wings gene induces muscle weakness and flightlessness in Bactrocera dorsalis (Diptera: Tephritidae). Insect Molecular Biology. 28 (2), 222-234 (2019).
- Kent, W. J. BLAT-the BLAST-like alignment tool. Genome Research. 12 (4), 656-664 (2002).
- Kim, D., Langmead, B., Salzberg, S. L. HISAT: A fast spliced aligner with low memory requirements. Nature Methods. 12 (4), 357-360 (2015).
- Danecek, P., et al. Twelve years of SAMtools and BCFtools. Gigascience. 10 (2), (2021).
- Kovaka, S., et al. Transcriptome assembly from long-read RNA-seq alignments with StringTie2. Genome Biology. 20 (1), 278 (2019).
- . TransDecoder Available from: https://github.com/TransDecoder/TransDecoder/releases/tag/TransDecoder-v5.5.0 (2018)
- Robinson, J. T., et al. Integrative genomics viewer. Nature Biotechnology. 29 (1), 24-26 (2011).
- Chang, H., et al. A pheromone antagonist regulates optimal mating time in the moth Helicoverpa armigera. Current Biology. 27 (11), 1610-1615 (2017).
- Xie, S., et al. sgRNAcas9: a software package for designing CRISPR sgRNA and evaluating potential off-target cleavage sites. PloS One. 9 (6), 100448 (2014).
- Zheng, Q. P., et al. Precise gene deletion and replacement using the CRISPR/Cas9 system in human cells. Biotechniques. 57 (3), 115-124 (2014).
- Ren, L., et al. Rectal bacteria produce sex pheromones in the male oriental fruit fly. Current Biology. 31 (10), 2220-2226 (2021).
- Xiao, Q., et al. Application of CRISPR/Cas9-based gene editing in HIV-1/AIDS therapy. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 9, 69 (2019).
- El-Mounadi, K., et al. Principles, applications, and biosafety of plant genome editing using CRISPR-Cas9. Frontiers in Plant Science. 11, 56 (2020).
- Hsu, P. D., et al. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 157 (6), 1262-1278 (2014).
- Labun, K., et al. CHOPCHOP v3: expanding the CRISPR web toolbox beyond genome editing. Nucleic Acids Research. 47, 171-174 (2019).
- Ai, D., et al. Embryo microinjection and knockout mutant identification of CRISPR/Cas9 genome-edited Helicoverpa armigera (Hübner). Journal of Visualized Experiments. (173), e62068 (2021).
- Xie, S., et al. sgRNAcas9: a software package for designing CRISPR sgRNA and evaluating potential off-target cleavage sites. PloS One. 9 (6), 100448 (2014).
- Gratz, S. J., et al. Genome engineering of Drosophila with the CRISPR RNA-guided Cas9 nuclease. Genetics. 194 (4), 1029-1035 (2013).
- Zhu, G. H., et al. Knockout of juvenile hormone receptor, Methoprene-tolerant, induces black larval phenotype in the yellow fever mosquito, Aedes aegypti. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (43), 21501-21507 (2019).
- Laohakieat, K., Isasawin, S., Thanaphum, S. The transformer-2 and fruitless characterisation with developmental expression profiles of sex-determining genes in Bactrocera dorsalis and B. correcta. Scientific Reports. 10 (1), 1-13 (2020).
- Gabrieli, P., et al. Sperm-less males modulate female behaviour in Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae). Insect Biochemistry and Molecular Biology. 79, 13-26 (2016).
