Протоколы для CRISPR/Cas9 мутагенеза восточной плодовой мухи Bactrocera dorsalis
Summary
В данной статье представлены пошаговые протоколы для мутагенеза CRISPR/Cas9 восточной плодовой мухи Bactrocera dorsalis. Подробные шаги, предусмотренные этим стандартизированным протоколом, послужат полезным руководством для генерации мутантных мух для функциональных исследований генов у B. dorsalis.
Abstract
Восточная плодовая муха, Bactrocera dorsalis, является высокоинвазивным и адаптивным видом вредителей, который наносит ущерб цитрусовым и более чем 150 другим фруктовым культурам во всем мире. Поскольку взрослые плодовые мушки обладают большой летной способностью, а самки откладывают яйца под кожуру плодов, инсектициды, требующие прямого контакта с вредителем, обычно плохо работают в поле. С развитием молекулярно-биологических инструментов и высокопроизводительной технологии секвенирования многие ученые пытаются разработать экологически чистые стратегии борьбы с вредителями. К ним относятся RNAi или пестициды на основе редактирования генов, которые подавляют или заглушают гены (молекулярные мишени), такие как обонятельные гены, участвующие в поисковом поведении, у различных насекомых-вредителей. Чтобы адаптировать эти стратегии для борьбы с восточной плодовой мухой, необходимы эффективные методы исследования функциональных генов. Гены с критическими функциями в выживании и размножении B. dorsalis служат хорошими молекулярными мишенями для нокдауна генов и / или глушения. Система CRISPR/Cas9 является надежным методом, используемым для редактирования генов, особенно у насекомых. В данной статье представлен систематический метод мутагенеза CRISPR/Cas9 B. dorsalis, включая разработку и синтез направляющих РНК, сбор эмбрионов, инъекцию эмбрионов, выращивание насекомых и мутантный скрининг. Эти протоколы послужат полезным руководством для генерации мутантных мух для исследователей, заинтересованных в функциональных исследованиях генов у B. dorsalis.
Introduction
Восточная плодовая муха, Bactrocera dorsalis, является космополитическим видом насекомых-вредителей, который наносит ущерб более чем 150 видам фруктовых культур, включая гуаву, манго, Eugenia spp., суринамскую вишню, цитрусовые, мушмулу и папайю1. Ущерб, причиненный только провинции Гуандун (Китай), оценивается более чем в 200 миллионов юаней. Взрослые самки вставляют свои яйца под кожуру созревающих или созревших плодов, вызывая гниение и абсциссию плодов, что снижает качество плодов и общую урожайность урожая2. Поскольку взрослые плодовые мушки обладают большой летной способностью, а их личинки попадают в кожуру плодов, инсектициды, требующие прямого контакта с вредителем, плохо работают в поле. Кроме того, широкое использование инсектицидов повысило устойчивость B. dorsalis к различным сельскохозяйственным химикатам, что еще больше затрудняет борьбу с этими вредными вредителями3. Поэтому разработка эффективных и экологически чистых стратегий борьбы с вредителями крайне необходима.
В последнее время, с развитием молекулярно-биологических инструментов и высокопроизводительных технологий секвенирования, ученые пытаются разработать экологически чистые стратегии борьбы с вредителями, такие как RNAi, которые нацелены на функциональность важных генов (молекулярных мишеней) различных насекомых-вредителей. Гены, которые имеют решающее значение для выживания и размножения вредителя, могут быть идентифицированы с помощью функциональных генных исследований и в дальнейшем служить потенциальными молекулярными мишенями для улучшения специально целевых и экологически чистых инструментов борьбы с вредителями4. Чтобы адаптировать такие стратегии к борьбе с восточной плодовой мухой, необходимы эффективные методы исследования функциональных генов.
Система эндонуклеазы CRISPR/Cas (кластеризованная регулярно чередующаяся короткая палиндромная система/CRISPR-ассоциированная) была первоначально обнаружена у бактерий и архей и оказалась адаптивным механизмом, участвующим в распознавании и деградации чужеродной внутриклеточной ДНК, такой как та, которая вводится путем заражения бактериофагов5. В системе CRISPR типа II эндонуклеаза Cas9 управляется небольшими ассоциированными РНК (crRNA и tracrRNA) для расщепления проникающей ДНК 6,7,8 и стала одним из наиболее широко используемых инструментов для редактирования генов на сегодняшний день 9,10,11,12. Поскольку система CRISPR/Cas9 имеет ряд преимуществ, таких как высокая эффективность глушения генов и низкая стоимость, она уже применялась для редактирования генов у различных видов насекомых, включая Aedes aegypti13,14, Locusta migratoria15 и Bombyx mori16. У B. dorsalis гены, связанные с цветом тела, диморфизмом крыльев и определением пола, были успешно выбиты с использованием CRISPR/Cas9 17,18,19. Однако подробные процедуры применения CRISPR/Cas9 у этого насекомого остаются неполными. Кроме того, некоторые шаги, предоставленные исследователями для редактирования гена B. dorsalis, также разнообразны и нуждаются в стандартизации. Например, формы Cas9 отличались в опубликованных ссылках 17,18,19.
В данной статье представлен систематический метод мутагенеза B. dorsalis с использованием системы CRISPR/Cas9, включая разработку и синтез направляющих РНК, сбор эмбрионов, инъекцию эмбрионов, выращивание насекомых и мутантный скрининг. Этот протокол послужит полезным руководством для генерации мутантных мух для исследователей, которые заинтересованы в функциональных исследованиях генов у B. dorsalis.
Protocol
Representative Results
Discussion
Система CRISPR/Cas9 является наиболее широко используемым инструментом редактирования генов и имеет различные применения, такие как генная трепия30, селекция сельскохозяйственных культур31 и фундаментальные исследования генных фукций32. Эта система у?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Шэньчжэньской программой науки и техники (грант No KQTD20180411143628272) и специальными фондами для научно-технических инноваций и промышленного развития нового района Шэньчжэнь Дапенг (грант No PT202101-02).
Materials
| 6x DNA Loading Buffer | TransGen Biotech | GH101-01 | |
| Artificial climate chamber | ShangHai BluePard | MGC-350P | |
| AxyPrep Genomic DNA Mini-Extraction Kit | Axygen | AP-MN-MS-GDNA-250G | |
| BLAT | NA | NA | For searching potential gene loci in the genome |
| Capillary Glass | WPI | 1B100F-4 | |
| Eppendorf InjectMan 4 micromanipulator | Eppendorf | InjectMan 4 | |
| GeneArt Precision gRNA Synthesis Kit | Thermo Fisher Scientific | A29377 | |
| Hisat2 | NA | NA | For aligning the transcriptome to the acquired gene loci |
| IGV | NA | NA | For visualizing the results from Transdecoder |
| Microgrinder | NARISHIGE | EG-401 | |
| Olympus Microscope | Olympus Corporation | SZ2-ILST | |
| pEASY-Blunt Cloning Kit | TransGen Biotech | CB101-02 | https://www.transgenbiotech.com/data/upload/pdf/CB101_2022-07-14.pdf |
| Phenol red solution | Sigma-Aldrich | P0290-100ML | |
| Pipette cookbook 2018 P-97 & P-1000 Micropipette Pullers | Instrument Company | https://www.sutter.com/PDFs/cookbook.pdf | |
| PrimeSTAR HS (Premix) | Takara Biomedical Technology | R040A | |
| SAMtools | NA | NA | For generating the sorted bam files |
| sgRNAcas9-AI | NA | NA | sgRNA design http://123.57.239.141:8080/home |
| Sutter Micropipette Puller Sutter | Instrument Company | P-97 | |
| Trans2K DNA Marker | TransGen Biotech | BM101-02 | |
| Transdecoder | NA | NA | For combining the results of assemble transcripts and gene loci information https://github.com/TransDecoder/TransDecoder/releases/tag/TransDecoder-v5.5.0 |
| TrueCut Cas9 Protein v2 | Thermo Fisher Scientific | A36498 | |
| Ultra-trace biological detector | Thermo Fisher Scientific | Nanodrop 2000C |
References
- Christenson, L. D., Foote, R. H. Biology of fruit flies. Annual Review of Entomology. 5 (1), 171-192 (1960).
- Ma, X., et al. The assessment of the economic losses caused by Bactrocera dorsalis, B. cucurbitae and B. tau to Guangdong province. Plant Quarantine. 27 (3), 50-56 (2013).
- Jin, M., et al. Chemical control measures and drug resistance management of Bactrocera dorsalis. Agrochemicals. 60 (1), 1-5 (2021).
- Yang, B., Liu, Y., Wang, B., Wang, G. Olfaction-based behaviorally manipulated technology of pest insects: research progress, opportunities and challenges. Bulletin of National Natural Science Foundation of China. 34 (4), 441-446 (2020).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Garneau, J. E., et al. The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA. Nature. 468 (7320), 67-71 (2010).
- Pyzocha, N. K., et al. RNA-guided genome editing of mammalian cells. Gene Correction. , 269-277 (2014).
- Weiss, D., et al. CRISPR-Cas systems: new players in gene regulation and bacterial physiology. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 4, 37 (2014).
- Doudna, J. A., Charpentier, E. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346 (6213), 1258096 (2014).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Li, D., et al. Heritable gene targeting in the mouse and rat using a CRISPR-Cas system. Nature Biotechnology. 31 (8), 681-683 (2013).
- Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153 (4), 910-918 (2013).
- Li, H., et al. Generating mutant Aedes aegypti mosquitoes using the CRISPR/Cas9 system. STAR protocols. 2 (2), 100432 (2021).
- Zhu, G. -. H., et al. Expanding the toolkit for genome editing in a disease vector, Aedes aegypti: transgenic lines expressing Cas9 and single guide RNA induce efficient mutagenesis. The CRISPR Journal. 4 (6), 846-853 (2021).
- Li, Y., et al. CRISPR/Cas9 in locusts: Successful establishment of an olfactory deficiency line by targeting the mutagenesis of an odorant receptor co-receptor (Orco). Insect Biochemistry and Molecular Biology. 79, 27-35 (2016).
- Liu, Q., et al. Deletion of the Bombyx mori odorant receptor co-receptor (BmOrco) impairs olfactory sensitivity in silkworms. Insect Biochemistry & Molecular Biology. 86, 58-67 (2017).
- Zhao, S., et al. Efficient somatic and germline genome engineering of Bactrocera dorsalis by the CRISPR/Cas9 system. Pest Management Science. 75 (7), 1921-1932 (2019).
- Bai, X., et al. CRISPR/Cas9-mediated knockout of the eye pigmentation gene white leads to alterations in colour of head spots in the oriental fruit fly, Bactrocera dorsalis. Insect Molecular Biology. 28 (6), 837-849 (2019).
- Zheng, W., et al. Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated 9-mediated mutagenesis of the multiple edematous wings gene induces muscle weakness and flightlessness in Bactrocera dorsalis (Diptera: Tephritidae). Insect Molecular Biology. 28 (2), 222-234 (2019).
- Kent, W. J. BLAT-the BLAST-like alignment tool. Genome Research. 12 (4), 656-664 (2002).
- Kim, D., Langmead, B., Salzberg, S. L. HISAT: A fast spliced aligner with low memory requirements. Nature Methods. 12 (4), 357-360 (2015).
- Danecek, P., et al. Twelve years of SAMtools and BCFtools. Gigascience. 10 (2), (2021).
- Kovaka, S., et al. Transcriptome assembly from long-read RNA-seq alignments with StringTie2. Genome Biology. 20 (1), 278 (2019).
- . TransDecoder Available from: https://github.com/TransDecoder/TransDecoder/releases/tag/TransDecoder-v5.5.0 (2018)
- Robinson, J. T., et al. Integrative genomics viewer. Nature Biotechnology. 29 (1), 24-26 (2011).
- Chang, H., et al. A pheromone antagonist regulates optimal mating time in the moth Helicoverpa armigera. Current Biology. 27 (11), 1610-1615 (2017).
- Xie, S., et al. sgRNAcas9: a software package for designing CRISPR sgRNA and evaluating potential off-target cleavage sites. PloS One. 9 (6), 100448 (2014).
- Zheng, Q. P., et al. Precise gene deletion and replacement using the CRISPR/Cas9 system in human cells. Biotechniques. 57 (3), 115-124 (2014).
- Ren, L., et al. Rectal bacteria produce sex pheromones in the male oriental fruit fly. Current Biology. 31 (10), 2220-2226 (2021).
- Xiao, Q., et al. Application of CRISPR/Cas9-based gene editing in HIV-1/AIDS therapy. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 9, 69 (2019).
- El-Mounadi, K., et al. Principles, applications, and biosafety of plant genome editing using CRISPR-Cas9. Frontiers in Plant Science. 11, 56 (2020).
- Hsu, P. D., et al. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 157 (6), 1262-1278 (2014).
- Labun, K., et al. CHOPCHOP v3: expanding the CRISPR web toolbox beyond genome editing. Nucleic Acids Research. 47, 171-174 (2019).
- Ai, D., et al. Embryo microinjection and knockout mutant identification of CRISPR/Cas9 genome-edited Helicoverpa armigera (Hübner). Journal of Visualized Experiments. (173), e62068 (2021).
- Xie, S., et al. sgRNAcas9: a software package for designing CRISPR sgRNA and evaluating potential off-target cleavage sites. PloS One. 9 (6), 100448 (2014).
- Gratz, S. J., et al. Genome engineering of Drosophila with the CRISPR RNA-guided Cas9 nuclease. Genetics. 194 (4), 1029-1035 (2013).
- Zhu, G. H., et al. Knockout of juvenile hormone receptor, Methoprene-tolerant, induces black larval phenotype in the yellow fever mosquito, Aedes aegypti. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (43), 21501-21507 (2019).
- Laohakieat, K., Isasawin, S., Thanaphum, S. The transformer-2 and fruitless characterisation with developmental expression profiles of sex-determining genes in Bactrocera dorsalis and B. correcta. Scientific Reports. 10 (1), 1-13 (2020).
- Gabrieli, P., et al. Sperm-less males modulate female behaviour in Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae). Insect Biochemistry and Molecular Biology. 79, 13-26 (2016).
