CRISPR / Cas9 Oryantal Meyve Sineği Bactrocera dorsalis'in mutagenezi için protokoller
Summary
Bu yazıda, Oryantal meyve sineği Bactrocera dorsalis’in CRISPR / Cas9 mutagenezi için adım adım protokoller sunulmaktadır. Bu standartlaştırılmış protokol tarafından sağlanan ayrıntılı adımlar, B. dorsalis’teki fonksiyonel gen çalışmaları için mutant sineklerin üretilmesi için yararlı bir rehber görevi görecektir.
Abstract
Oryantal meyve sineği, Bactrocera dorsalis, narenciye ve dünya çapında 150’den fazla diğer meyve ürününe zarar veren oldukça istilacı ve uyarlanabilir bir haşere türüdür. Yetişkin meyve sinekleri büyük uçuş kapasitesine sahip olduklarından ve dişiler yumurtalarını meyve derilerinin altına bıraktıklarından, haşere ile doğrudan temas gerektiren böcek öldürücüler genellikle tarlada zayıf performans gösterir. Moleküler biyolojik araçların ve yüksek verimli dizileme teknolojisinin geliştirilmesiyle, birçok bilim adamı çevre dostu haşere yönetimi stratejileri geliştirmeye çalışmaktadır. Bunlar, çeşitli böcek zararlılarında, arama davranışında yer alan koku alma genleri gibi genleri (moleküler hedefleri) aşağı regüle eden veya susturan RNAi veya gen düzenleme tabanlı pestisitleri içerir. Bu stratejileri Oryantal meyve sineği kontrolüne uyarlamak için, fonksiyonel gen araştırması için etkili yöntemlere ihtiyaç vardır. B. dorsalis’in hayatta kalması ve üremesinde kritik fonksiyonlara sahip genler, gen yıkımı ve / veya susturulması için iyi moleküler hedefler olarak hizmet eder. CRISPR / Cas9 sistemi, özellikle böceklerde gen düzenleme için kullanılan güvenilir bir tekniktir. Bu yazıda B. dorsalis’in CRISPR/Cas9 mutagenezisi için kılavuz RNA’ların tasarımı ve sentezi, embriyo toplama, embriyo enjeksiyonu, böcek yetiştirme ve mutant taraması gibi sistematik bir yöntem sunulmaktadır. Bu protokoller, B. dorsalis’teki fonksiyonel gen çalışmaları ile ilgilenen araştırmacılar için mutant sinekler üretmek için yararlı bir rehber görevi görecektir.
Introduction
Oryantal meyve sineği, Bactrocera dorsalis , guava, mango, Eugenia spp., Surinam kirazı, narenciye, yenidünya ve papaya1 dahil olmak üzere 150’den fazla meyve mahsulü türüne zarar veren kozmopolit bir böcek haşere türüdür. Sadece Guangdong Eyaletinde (Çin) meydana gelen hasarın 200 milyon yuan’ın üzerinde olduğu tahmin edilmektedir. Yetişkin dişiler yumurtalarını olgunlaşan veya olgunlaşmış meyvelerin derisinin altına yerleştirir, bu da meyvenin çürümesine ve yok olmasına neden olur, bu da meyve kalitesini ve mahsulün genel verimini azaltır2. Yetişkin meyve sinekleri büyük uçuş kapasitesine sahip olduklarından ve larvaları meyve derisine girdiğinden, haşere ile doğrudan temas gerektiren böcek öldürücüler tarlada zayıf performans gösterir. Ek olarak, insektisitlerin yaygın kullanımı, B. dorsalis’in çeşitli tarımsal kimyasallara karşı direncini arttırmış ve bu zararlı zararlıların kontrolünü daha da zorlaştırmıştır3. Bu nedenle, etkili ve çevre dostu haşere yönetimi stratejilerinin geliştirilmesine umutsuzca ihtiyaç duyulmaktadır.
Son zamanlarda, moleküler biyolojik araçların ve yüksek verimli dizileme teknolojilerinin geliştirilmesiyle, bilim adamları, çeşitli böcek zararlılarının önemli genlerinin (moleküler hedeflerin) işlevselliğini hedefleyen RNAi gibi çevre dostu haşere yönetimi stratejileri geliştirmeye çalışıyorlar. Zararlıların hayatta kalması ve üremesi için kritik olan genler, fonksiyonel gen çalışmaları yoluyla tanımlanabilir ve ayrıca özel olarak hedeflenmiş ve çevre dostu haşere yönetim araçlarının iyileştirilmesi için potansiyel moleküler hedefler olarak hizmet edebilir4. Bu tür stratejileri Oryantal meyve sineği kontrolüne uyarlamak için, fonksiyonel gen araştırması için etkili yöntemlere ihtiyaç vardır.
CRISPR / Cas (kümelenmiş düzenli aralıklarla kısa palindromik tekrarlar / CRISPR ile ilişkili) endonükleaz sistemi başlangıçta bakteri ve arkelerde keşfedildi ve bakteriyofajların enfekte edilmesiyle ortaya çıkanlar gibi yabancı hücre içi DNA’nın tanınması ve parçalanmasında rol oynayan adaptif bir mekanizma olduğu bulundu5. Tip II CRISPR sisteminde, Cas9 endonükleaz, küçük ilişkili RNA’lar (crRNA ve tracrRNA) tarafından izinsiz DNA 6,7,8’i parçalamak için yönlendirilir ve bugüne kadar 9,10,11,12 gen düzenleme için en yaygın kullanılan araçlardan biri haline gelmiştir. CRISPR / Cas9 sistemi, gen susturmanın yüksek verimliliği ve düşük maliyet gibi çeşitli avantajlara sahip olduğundan, Aedes aegypti13,14, Locusta migratoria15 ve Bombyx mori16 dahil olmak üzere çeşitli böcek türlerinde gen düzenleme için zaten uygulanmıştır. B. dorsalis’te, vücut rengi, kanat dimorfizmi ve cinsiyet tayini ile ilgili genler, CRISPR / Cas917,18,19 kullanılarak başarıyla nakavt edilmiştir. Bununla birlikte, bu böcekte CRISPR / Cas9 uygulaması için ayrıntılı prosedürler eksik kalmaktadır. Ayrıca, araştırmacılar tarafından B. dorsalis gen düzenlemesi için sağlanan bazı adımlar da çeşitlidir ve standardizasyona ihtiyaç duymaktadır. Örneğin, Cas9’un formlarıyayınlanmış referanslarda farklıydı 17,18,19.
Bu yazıda CRISPR/Cas9 sistemi kullanılarak B. dorsalis’in mutagenezisi için kılavuz RNA’ların tasarımı ve sentezi, embriyo toplama, embriyo enjeksiyonu, böcek yetiştirme ve mutant taraması dahil olmak üzere sistematik bir yöntem sunulmaktadır. Bu protokol, B. dorsalis’teki fonksiyonel gen çalışmalarıyla ilgilenen araştırmacılar için mutant sinekler üretmek için yararlı bir rehber görevi görecektir.
Protocol
Representative Results
Discussion
CRISPR / Cas9 sistemi en yaygın kullanılan gen düzenleme aracıdır ve gen threpy30, mahsul ıslahı31 ve gen fuksiyonlarının temel çalışmaları32 gibi çeşitli uygulamalara sahiptir. Bu sistem zaten çeşitli böcek türlerinde gen düzenleme için uygulanmış ve zararlılarda fonksiyonel gen çalışmaları için etkili bir araç olarak hizmet etmiştir. Burada sunduğumuz protokoller, kılavuz RNA’ların tasarımı ve sentezi, embriyolar…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Shenzhen Bilim ve Teknoloji Programı (Hibe No. KQTD20180411143628272) ve Shenzhen Dapeng Yeni Bölgesi’nin bilim teknolojisi inovasyonu ve endüstriyel gelişimi için özel fonlar (Hibe No. PT202101-02) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| 6x DNA Loading Buffer | TransGen Biotech | GH101-01 | |
| Artificial climate chamber | ShangHai BluePard | MGC-350P | |
| AxyPrep Genomic DNA Mini-Extraction Kit | Axygen | AP-MN-MS-GDNA-250G | |
| BLAT | NA | NA | For searching potential gene loci in the genome |
| Capillary Glass | WPI | 1B100F-4 | |
| Eppendorf InjectMan 4 micromanipulator | Eppendorf | InjectMan 4 | |
| GeneArt Precision gRNA Synthesis Kit | Thermo Fisher Scientific | A29377 | |
| Hisat2 | NA | NA | For aligning the transcriptome to the acquired gene loci |
| IGV | NA | NA | For visualizing the results from Transdecoder |
| Microgrinder | NARISHIGE | EG-401 | |
| Olympus Microscope | Olympus Corporation | SZ2-ILST | |
| pEASY-Blunt Cloning Kit | TransGen Biotech | CB101-02 | https://www.transgenbiotech.com/data/upload/pdf/CB101_2022-07-14.pdf |
| Phenol red solution | Sigma-Aldrich | P0290-100ML | |
| Pipette cookbook 2018 P-97 & P-1000 Micropipette Pullers | Instrument Company | https://www.sutter.com/PDFs/cookbook.pdf | |
| PrimeSTAR HS (Premix) | Takara Biomedical Technology | R040A | |
| SAMtools | NA | NA | For generating the sorted bam files |
| sgRNAcas9-AI | NA | NA | sgRNA design http://123.57.239.141:8080/home |
| Sutter Micropipette Puller Sutter | Instrument Company | P-97 | |
| Trans2K DNA Marker | TransGen Biotech | BM101-02 | |
| Transdecoder | NA | NA | For combining the results of assemble transcripts and gene loci information https://github.com/TransDecoder/TransDecoder/releases/tag/TransDecoder-v5.5.0 |
| TrueCut Cas9 Protein v2 | Thermo Fisher Scientific | A36498 | |
| Ultra-trace biological detector | Thermo Fisher Scientific | Nanodrop 2000C |
References
- Christenson, L. D., Foote, R. H. Biology of fruit flies. Annual Review of Entomology. 5 (1), 171-192 (1960).
- Ma, X., et al. The assessment of the economic losses caused by Bactrocera dorsalis, B. cucurbitae and B. tau to Guangdong province. Plant Quarantine. 27 (3), 50-56 (2013).
- Jin, M., et al. Chemical control measures and drug resistance management of Bactrocera dorsalis. Agrochemicals. 60 (1), 1-5 (2021).
- Yang, B., Liu, Y., Wang, B., Wang, G. Olfaction-based behaviorally manipulated technology of pest insects: research progress, opportunities and challenges. Bulletin of National Natural Science Foundation of China. 34 (4), 441-446 (2020).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Garneau, J. E., et al. The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA. Nature. 468 (7320), 67-71 (2010).
- Pyzocha, N. K., et al. RNA-guided genome editing of mammalian cells. Gene Correction. , 269-277 (2014).
- Weiss, D., et al. CRISPR-Cas systems: new players in gene regulation and bacterial physiology. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 4, 37 (2014).
- Doudna, J. A., Charpentier, E. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346 (6213), 1258096 (2014).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Li, D., et al. Heritable gene targeting in the mouse and rat using a CRISPR-Cas system. Nature Biotechnology. 31 (8), 681-683 (2013).
- Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153 (4), 910-918 (2013).
- Li, H., et al. Generating mutant Aedes aegypti mosquitoes using the CRISPR/Cas9 system. STAR protocols. 2 (2), 100432 (2021).
- Zhu, G. -. H., et al. Expanding the toolkit for genome editing in a disease vector, Aedes aegypti: transgenic lines expressing Cas9 and single guide RNA induce efficient mutagenesis. The CRISPR Journal. 4 (6), 846-853 (2021).
- Li, Y., et al. CRISPR/Cas9 in locusts: Successful establishment of an olfactory deficiency line by targeting the mutagenesis of an odorant receptor co-receptor (Orco). Insect Biochemistry and Molecular Biology. 79, 27-35 (2016).
- Liu, Q., et al. Deletion of the Bombyx mori odorant receptor co-receptor (BmOrco) impairs olfactory sensitivity in silkworms. Insect Biochemistry & Molecular Biology. 86, 58-67 (2017).
- Zhao, S., et al. Efficient somatic and germline genome engineering of Bactrocera dorsalis by the CRISPR/Cas9 system. Pest Management Science. 75 (7), 1921-1932 (2019).
- Bai, X., et al. CRISPR/Cas9-mediated knockout of the eye pigmentation gene white leads to alterations in colour of head spots in the oriental fruit fly, Bactrocera dorsalis. Insect Molecular Biology. 28 (6), 837-849 (2019).
- Zheng, W., et al. Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated 9-mediated mutagenesis of the multiple edematous wings gene induces muscle weakness and flightlessness in Bactrocera dorsalis (Diptera: Tephritidae). Insect Molecular Biology. 28 (2), 222-234 (2019).
- Kent, W. J. BLAT-the BLAST-like alignment tool. Genome Research. 12 (4), 656-664 (2002).
- Kim, D., Langmead, B., Salzberg, S. L. HISAT: A fast spliced aligner with low memory requirements. Nature Methods. 12 (4), 357-360 (2015).
- Danecek, P., et al. Twelve years of SAMtools and BCFtools. Gigascience. 10 (2), (2021).
- Kovaka, S., et al. Transcriptome assembly from long-read RNA-seq alignments with StringTie2. Genome Biology. 20 (1), 278 (2019).
- . TransDecoder Available from: https://github.com/TransDecoder/TransDecoder/releases/tag/TransDecoder-v5.5.0 (2018)
- Robinson, J. T., et al. Integrative genomics viewer. Nature Biotechnology. 29 (1), 24-26 (2011).
- Chang, H., et al. A pheromone antagonist regulates optimal mating time in the moth Helicoverpa armigera. Current Biology. 27 (11), 1610-1615 (2017).
- Xie, S., et al. sgRNAcas9: a software package for designing CRISPR sgRNA and evaluating potential off-target cleavage sites. PloS One. 9 (6), 100448 (2014).
- Zheng, Q. P., et al. Precise gene deletion and replacement using the CRISPR/Cas9 system in human cells. Biotechniques. 57 (3), 115-124 (2014).
- Ren, L., et al. Rectal bacteria produce sex pheromones in the male oriental fruit fly. Current Biology. 31 (10), 2220-2226 (2021).
- Xiao, Q., et al. Application of CRISPR/Cas9-based gene editing in HIV-1/AIDS therapy. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 9, 69 (2019).
- El-Mounadi, K., et al. Principles, applications, and biosafety of plant genome editing using CRISPR-Cas9. Frontiers in Plant Science. 11, 56 (2020).
- Hsu, P. D., et al. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 157 (6), 1262-1278 (2014).
- Labun, K., et al. CHOPCHOP v3: expanding the CRISPR web toolbox beyond genome editing. Nucleic Acids Research. 47, 171-174 (2019).
- Ai, D., et al. Embryo microinjection and knockout mutant identification of CRISPR/Cas9 genome-edited Helicoverpa armigera (Hübner). Journal of Visualized Experiments. (173), e62068 (2021).
- Xie, S., et al. sgRNAcas9: a software package for designing CRISPR sgRNA and evaluating potential off-target cleavage sites. PloS One. 9 (6), 100448 (2014).
- Gratz, S. J., et al. Genome engineering of Drosophila with the CRISPR RNA-guided Cas9 nuclease. Genetics. 194 (4), 1029-1035 (2013).
- Zhu, G. H., et al. Knockout of juvenile hormone receptor, Methoprene-tolerant, induces black larval phenotype in the yellow fever mosquito, Aedes aegypti. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (43), 21501-21507 (2019).
- Laohakieat, K., Isasawin, S., Thanaphum, S. The transformer-2 and fruitless characterisation with developmental expression profiles of sex-determining genes in Bactrocera dorsalis and B. correcta. Scientific Reports. 10 (1), 1-13 (2020).
- Gabrieli, P., et al. Sperm-less males modulate female behaviour in Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae). Insect Biochemistry and Molecular Biology. 79, 13-26 (2016).
