Protokoller for CRISPR/Cas9 Mutagenese av orientalsk fruktflue Bactrocera dorsalis

Summary

Dette papiret presenterer trinnvise protokoller for CRISPR / Cas9 mutagenese av orientalsk fruktflue Bactrocera dorsalis. Detaljerte trinn gitt av denne standardiserte protokollen vil tjene som en nyttig veiledning for å generere mutantfluer for funksjonelle genstudier i B. dorsalis.

Abstract

Den orientalske fruktfluen, Bactrocera dorsalis, er en svært invasiv og adaptiv skadedyrsart som forårsaker skade på sitrus og over 150 andre fruktavlinger over hele verden. Siden voksne fruktfluer har stor flykapasitet og kvinner legger eggene sine under skinnene av frukt, utfører insektmidler som krever direkte kontakt med vanligvis dårlig i feltet. Med utviklingen av molekylærbiologiske verktøy og sekvenseringsteknologi med høy gjennomstrømning, forsøker mange forskere å utvikle miljøvennlige skadedyrsbekjempelsesstrategier. Disse inkluderer RNAi eller genredigeringsbaserte plantevernmidler som nedregulerer eller stilner gener (molekylære mål), for eksempel olfaktoriske gener involvert i søkeadferd, i ulike. For å tilpasse disse strategiene for orientalsk bananfluekontroll er det behov for effektive metoder for funksjonell genforskning. Gener med kritiske funksjoner i overlevelse og reproduksjon av B. dorsalis tjener som gode molekylære mål for gen knockdown og / eller silencing. CRISPR/Cas9-systemet er en pålitelig teknikk som brukes til genredigering, spesielt hos insekter. Dette papiret presenterer en systematisk metode for CRISPR / Cas9 mutagenese av B. dorsalis, inkludert design og syntese av guide-RNA, innsamling av embryoer, embryoinjeksjon, insektoppdrett og mutant screening. Disse protokollene vil tjene som en nyttig guide for å generere mutantfluer for forskere som er interessert i funksjonelle genstudier i B. dorsalis.

Introduction

Den orientalske fruktfluen, Bactrocera dorsalis , er en kosmopolitisk insekt skadedyrsart som forårsaker skade på over 150 arter av fruktavlinger, inkludert guava, mango, Eugenia spp., Surinam kirsebær, sitrus, loquat og papaya¹. Skaden forårsaket i Guangdong-provinsen (Kina) alene er anslått til over 200 millioner yuans. Voksne kvinner setter eggene sine under huden av modne eller modne frukter, noe som forårsaker forfall og abscission av frukten, noe som reduserer fruktkvaliteten og det totale utbyttet^{av avlingen}. Siden voksne fruktfluer har stor flykapasitet og larvene deres borer seg inn i frukthuden, utfører insektmidler som krever direkte kontakt med dårlig i feltet. I tillegg har den omfattende bruken av insektmidler økt motstanden til B. dorsalis mot ulike landbrukskjemikalier, noe som gjør kontrollen av disse skadelige enda vanskeligere³. Derfor er det desperat behov for utvikling av effektive og miljøvennlige skadedyrsbekjempelsesstrategier.

Nylig, med utviklingen av molekylærbiologiske verktøy og høykapasitetssekvenseringsteknologier, forsøker forskere å utvikle miljøvennlige skadedyrsbekjempelsesstrategier, for eksempel RNAi, som retter seg mot funksjonaliteten til viktige gener (molekylære mål) for ulike. Gener som er kritiske for overlevelse og reproduksjon av kan identifiseres gjennom funksjonelle genstudier og videre tjene som potensielle molekylære mål for forbedring av spesielt målrettede og miljøvennlige skadedyrsbekjempelsesverktøy⁴. For å tilpasse slike strategier til orientalsk bananfluekontroll er det behov for effektive metoder for funksjonell genforskning.

CRISPR / Cas (gruppert regelmessig interspaced korte palindromiske repetisjoner / CRISPR-assosiert) endonuklease-systemet ble opprinnelig oppdaget i bakterier og archaea og funnet å være en adaptiv mekanisme involvert i anerkjennelse og nedbrytning av fremmed intracellulært DNA, slik som det som ble introdusert ved å infisere bakteriofager⁵. I type II CRISPR-systemet styres Cas9-endonuklease av små assosierte RNA (crRNA og tracrRNA) for å spalte trespassing DNA ^6,7,8 og har blitt et av de mest brukte verktøyene for genredigering til dags dato 9,10,11,12. Siden CRISPR/Cas9-systemet har flere fordeler, som høy effektivitet av geninaktivering og lave kostnader, har det allerede blitt brukt for genredigering i ulike insektarter, inkludert Aedes aegypti^13,14, Locusta migratoria¹⁵ og Bombyx mori¹⁶. I B. dorsalis har gener relatert til kroppsfarge, vingedimorfisme og kjønnsbestemmelse blitt slått ut ved hjelp av CRISPR / Cas9^17,18,19. Imidlertid forblir detaljerte prosedyrer for CRISPR / Cas9-påføring i dette insektet ufullstendige. Videre er noen trinn gitt av forskere for B. dorsalis genredigering også varierte og trenger standardisering. For eksempel var formene av Cas9 forskjellige i publiserte referanser^17,18,19.

Dette papiret gir en systematisk metode for mutagenese av B. dorsalis ved bruk av CRISPR / Cas9-systemet, inkludert design og syntese av guide-RNA, innsamling av embryoer, embryoinjeksjon, insektoppdrett og mutant screening. Denne protokollen vil tjene som en nyttig guide for å generere mutantfluer for forskere som er interessert i de funksjonelle genstudiene i B. dorsalis.

Protocol

1. Måldesign og in vitro-syntese av sgRNA Forutsi strukturen av målgener av interesse og bestem grensene mellom eksoner og introner via bioinformatisk analyse av B. dorsalis genomet (programvare som brukes her er oppført i materialtabellen).MERK: BLAT20 ble brukt til å søke potensielle gen loci i genomet. RNA-seq-avlesningene av høy kvalitet (transkriptom) ble justert til det oppkjøpte genet loci ved hjelp av Hisat2…

Representative Results

Denne protokollen presenterer detaljerte trinn for utvikling av B. dorsalis mutanter ved hjelp av CRISPR / Cas9-teknologi, inkludert representative resultater fra gDNA-seleksjon, innsamling av embryoer og mikroinjeksjon, insektvedlikehold og mutant screening. Eksemplet på målstedet for det valgte genet ligger i det tredje eksonet (figur 1C). Dette stedet er svært konservert, og et enkelt bånd ble detektert ved gelelektroforese for DNA-malen for syntet…

Discussion

CRISPR/Cas9-systemet er det mest brukte genredigeringsverktøyet og har ulike anvendelser, som gentrerepy³⁰, avl 31 og grunnleggende studier av genfuktioner³². Dette systemet er allerede tatt i bruk for genredigering hos ulike insektarter og har fungert som et effektivt verktøy for funksjonelle genstudier hos. Protokollene vi presenterer her standardiserer prosedyren for design og syntese av guide-RNA, innsamling av embryoer, embryoinjeksjon, insekt…

Materials

6x DNA Loading Buffer	TransGen Biotech	GH101-01
Artificial climate chamber	ShangHai BluePard	MGC-350P
AxyPrep Genomic DNA Mini-Extraction Kit	Axygen	AP-MN-MS-GDNA-250G
BLAT	NA	NA	For searching potential gene loci in the genome
Capillary Glass	WPI	1B100F-4
Eppendorf InjectMan 4 micromanipulator	Eppendorf	InjectMan 4
GeneArt Precision gRNA Synthesis Kit	Thermo Fisher Scientific	A29377
Hisat2	NA	NA	For aligning the transcriptome to the acquired gene loci
IGV	NA	NA	For visualizing the results from Transdecoder
Microgrinder	NARISHIGE	EG-401
Olympus Microscope	Olympus Corporation	SZ2-ILST
pEASY-Blunt Cloning Kit	TransGen Biotech	CB101-02	https://www.transgenbiotech.com/data/upload/pdf/CB101_2022-07-14.pdf
Phenol red solution	Sigma-Aldrich	P0290-100ML
Pipette cookbook 2018 P-97 & P-1000 Micropipette Pullers	Instrument Company		https://www.sutter.com/PDFs/cookbook.pdf
PrimeSTAR HS (Premix)	Takara Biomedical Technology	R040A
SAMtools	NA	NA	For generating the sorted bam files
sgRNAcas9-AI	NA	NA	sgRNA design http://123.57.239.141:8080/home
Sutter Micropipette Puller Sutter	Instrument Company	P-97
Trans2K DNA Marker	TransGen Biotech	BM101-02
Transdecoder	NA	NA	For combining the results of assemble transcripts and gene loci information https://github.com/TransDecoder/TransDecoder/releases/tag/TransDecoder-v5.5.0
TrueCut Cas9 Protein v2	Thermo Fisher Scientific	A36498
Ultra-trace biological detector	Thermo Fisher Scientific	Nanodrop 2000C