استكشاف طفرات Caspase وتعديل ما بعد الترجمة بواسطة مناهج النمذجة الجزيئية
Summary
يستخدم البروتوكول الحالي حزمة محاكاة جزيئية حيوية ويصف نهج الديناميات الجزيئية (MD) لنمذجة الكاسباز من النوع البري وأشكاله الطافرة. تسمح طريقة MD بتقييم التطور الديناميكي لهيكل الكاسباز والتأثير المحتمل للطفرات أو تعديلات ما بعد الترجمة.
Abstract
موت الخلايا المبرمج هو نوع من موت الخلايا المبرمج الذي يقضي على الخلايا التالفة ويتحكم في نمو الكائنات الحية متعددة الخلايا وتوازنها في الأنسجة. تلعب Caspases ، وهي عائلة من بروتياز السيستين ، دورا رئيسيا في بدء موت الخلايا المبرمج وتنفيذه. يتم ضبط نضوج الكاسباس ونشاطها من خلال تعديلات ما بعد الترجمة بطريقة ديناميكية للغاية. لتقييم تأثير التغييرات اللاحقة للترجمة ، يتم تحور المواقع المحتملة بشكل روتيني مع استمرار المخلفات لأي تعديلات. على سبيل المثال ، يتم استبدال بقايا سيرين بألانين أو حمض الأسبارتيك. ومع ذلك ، يمكن لمثل هذه البدائل أن تغير تشكيل موقع كاسباز النشط ، مما يؤدي إلى اضطرابات في النشاط التحفيزي والوظائف الخلوية. علاوة على ذلك ، يمكن أن تؤدي طفرات بقايا الأحماض الأمينية الأخرى الموجودة في المواضع الحرجة إلى كسر بنية ووظائف الكاسباز وتؤدي إلى اضطراب موت الخلايا المبرمج. لتجنب صعوبات استخدام المخلفات الطافرة ، يمكن تطبيق مناهج النمذجة الجزيئية بسهولة لتقدير التأثير المحتمل لبدائل الأحماض الأمينية على بنية الكاسباز. يسمح البروتوكول الحالي بنمذجة كل من الكاسباز من النوع البري وأشكاله الطافرة باستخدام حزمة المحاكاة الجزيئية الحيوية (العنبر) ومرافق الكمبيوتر العملاق لاختبار تأثير الطفرات على بنية البروتين ووظيفته.
Introduction
موت الخلايا المبرمج هو واحد من أكثر العمليات الخلوية التي تمت دراستها على نطاق واسع والتي تنظم التشكل وتوازن الأنسجة للكائنات متعددة الخلايا. يمكن أن يبدأ موت الخلايا المبرمج من خلال مجموعة واسعة من المحفزات الخارجية أو الداخلية ، مثل تنشيط مستقبلات الموت ، واضطراب في إشارات دورة الخلية ، وتلف الحمض النووي ، وإجهاد الشبكة الإندوبلازمية (ER) ، والالتهابات البكتيرية والفيروسية المختلفة1. يتم تصنيف الكاسباس – لاعبو موت الخلايا المبرمج الرئيسيين – تقليديا إلى مجموعتين: المبادرون (caspase-2 و caspase-8 و caspase-9 و caspase-10) والمستجيبات (caspase-3 و caspase-6 و caspase-7) ، اعتمادا على بنية مجالها والمكان في سلسلة caspase 2,3. عند إشارات موت الخلية ، تتفاعل كاسباس البادئ مع جزيئات المحول التي تسهل التثبيط الناجم عن القرب والمعالجة الذاتية لتشكيل إنزيم نشط. يتم تنشيط كاسباس المستجيب من خلال الانقسام بواسطة كاسباس البادئ وتنفيذ خطوات التنفيذ النهائية عن طريق شق ركائز خلوية متعددة4.
يتم تنظيم نضوج ووظيفة البادئ والمستجيب caspases من خلال عدد كبير من الآليات المختلفة داخل الخلايا ، من بينها التعديل بعد الترجمة يلعب دورا لا غنى عنه في تعديل موت الخلية5. تؤدي إضافة مجموعات معدلة (الفسفرة أو النيتروسيل أو المثيلة أو الأستيلة) أو البروتينات (الوجود في كل مكان أو SUMOylation) إلى تغيير النشاط الأنزيمي للكاسباز أو تكوين البروتين واستقراره الذي ينظم موت الخلايا المبرمج. يتم تطبيق الطفرات الموجهة للموقع على نطاق واسع للتحقيق في مواقع التعديل المحتملة بعد الترجمة وتمييز دورها. عادة ما يتم استبدال موقع التعديل المفترض بحمض أميني آخر ، والذي لا يمكن تعديله مرة أخرى. وبالتالي ، يتم تحور سيرين وثريونين المفسفرين إلى ألانين ، ويتم استبدال مواقع اللايسين في كل مكان بالأرجينين. تتضمن الإستراتيجية الأخرى استبدال حمض أميني يحاكي بشكل خاص التعديل اللاحق للترجمة (على سبيل المثال ، تم استخدام الغلوتامات والأسبارتات لتقليد سيرين أو ثريونين المفسفر)6. ومع ذلك ، فإن بعض هذه البدائل الموجودة في المنطقة المجاورة العالية لموقع نشط أو في مواقع حرجة يمكن أن تغير بنية الكاسباز ، وتزعج النشاط التحفيزي ، وتقمع موت الخلايا المبرمج7. يمكن ملاحظة تأثيرات مماثلة في حالات الطفرات الخاطئة المرتبطة بالورم في جينات الكاسباز. على سبيل المثال ، أدت الطفرة المرتبطة بالورم في caspase-6 – R259H – إلى تغييرات توافقية للحلقات في جيب ربط الركيزة ، مما قلل من الدوران الحفاز الفعال للركائز8. يمكن أن يؤدي استبدال الأحماض الأمينية G325A في caspase-8 المحدد في سرطان الخلايا الحرشفية في الرأس والرقبة إلى إعاقة نشاط caspase-8 ، مما أدى إلى تعديل إشارات العامل النووي kB (NF-kB) وتعزيز تكوين الورم9.
لتقييم التأثير المحتمل لبدائل الأحماض الأمينية على بنية الكاسباز ووظيفته ، يمكن تطبيق النمذجة الجزيئية. تم وصف نهج الديناميات الجزيئية (MD) في هذا العمل لنمذجة الكاسباز من النوع البري وأشكاله الطافرة باستخدام حزمة المحاكاة الجزيئية الحيوية (العنبر). تعطي طريقة MD نظرة على التطور الديناميكي لبنية البروتين بعد إدخال الطفرات. تم تطوير حزمة Amber في الأصل بواسطة مجموعة Peter Kollman ، وأصبحت واحدة من أكثر أدوات البرامج شيوعا للمحاكاة الجزيئية الحيوية10،11،12،13. ينقسم هذا البرنامج إلى جزأين: (1) AmberTools ، وهي مجموعة من البرامج المستخدمة بشكل روتيني لإعداد النظام (تعيين نوع الذرة ، وإضافة الهيدروجين وجزيئات الماء الصريح ، وما إلى ذلك) وتحليل المسار ؛ و (2) العنبر ، الذي يتمحور حول برنامج محاكاة PMEMD. AmberTools عبارة عن حزمة مجانية (وشرط أساسي لتثبيت Amber نفسه) ، بينما يتم توزيع Amber بترخيص منفصل وهيكل رسوم. يمكن أن تؤدي المحاكاة المتوازية على كمبيوتر عملاق و / أو استخدام وحدات معالجة الرسومات (GPUs) إلى تحسين أداء البحث العلمي لديناميكيات بنية البروتين14 بشكل كبير. أحدث إصدارات البرامج المتاحة هي AmberTools21 و Amber20 ، ولكن يمكن أيضا استخدام البروتوكولات الموضحة مع الإصدارات السابقة.
Protocol
Representative Results
Discussion
يسمح نهج MD الموصوف بنمذجة كل من الأشكال البرية والمتحولة من caspase باستخدام حزم المحاكاة الجزيئية الحيوية. تتم مناقشة العديد من القضايا المهمة للمنهجية هنا. أولا ، يجب اختيار بنية بلورية تمثيلية للكاسباز من بنك بيانات البروتين. الأهم من ذلك ، كل من الأشكال الأحادية والثنائية من caspase مقبولة. ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل بمنحة من مؤسسة العلوم الروسية (17-75-20102 ، تطوير البروتوكول). تم دعم التجارب الموصوفة في قسم النتائج التمثيلية (تحليل الفسفرة) من قبل جمعيات السرطان في ستوكهولم (181301) والسويدية (190345).
Materials
| Amber20 | University of California, San Francisco | Software for molecular dynamics simulation http://ambermd.org |
|
| AmberTools21 | University of California, San Francisco | Software for molecular modeling and analysis http://ambermd.org |
References
- Olsson, M., Zhivotovsky, B. Caspases and cancer. Cell Death and Differentiation. 18 (9), 1441-1449 (2011).
- Lavrik, I. N., Golks, A., Krammer, P. H. Caspase: Pharmacological manipulation of cell death. Journal of Clinical Investigation. 115 (10), 2665-2672 (2005).
- Degterev, A., Boyce, M., Yuan, J. A decade of caspases. Oncogene. 22 (53), 8543-8567 (2003).
- Pop, C., Salvesen, G. S. Human caspases: Activation, specificity, and regulation. Journal of Biological Chemistry. 284 (33), 21777-21781 (2009).
- Zamaraev, A. V., Kopeina, G. S., Prokhorova, E. A., Zhivotovsky, B., Lavrik, I. N. Post-translational modification of caspases: The other side of apoptosis regulation. Trends in Cell Biology. 27 (5), 322-339 (2017).
- Pearlman, S. M., Serber, Z., Ferrell, J. E. A mechanism for the evolution of phosphorylation sites. Cell. 147 (4), 934-946 (2011).
- Zamaraev, A. V., et al. Requirement for Serine-384 in Caspase-2 processing and activity. Cell Death and Disease. 11 (10), 825 (2020).
- Dagbay, K. B., Hill, M. E., Barrett, E., Hardy, J. A. Tumor-associated mutations in caspase-6 negatively impact catalytic efficiency. Biochemistry. 56 (34), 4568-4577 (2017).
- Ando, M., et al. Cancer-associated missense mutations of caspase-8 activate nuclear factor-κB signaling. Cancer Science. 104 (8), 1002-1008 (2013).
- Case, D. A., et al. . AMBER 2020. , (2020).
- Salomon-Ferrer, R., Case, D. A., Walker, R. C. An overview of the Amber biomolecular simulation package. WIREs Computational Molecular Science. 3 (2), 198-210 (2013).
- Roe, D. R., Cheatham, T. E. PTRAJ and CPPTRAJ: Software for processing and analysis of molecular dynamics trajectory data. Journal of Chemical Theory and Computation. 9 (7), 3084-3095 (2013).
- Maier, J. A., et al. ff14SB: Improving the accuracy of protein side chain and backbone parameters from ff99SB. Journal of Chemical Theory and Computation. 11 (8), 3696-3713 (2015).
- Salomon-Ferrer, R., Götz, A. W., Poole, D., Le Grand, S., Walker, R. C. Routine microsecond molecular dynamics simulations with AMBER on GPUs. 2. Explicit solvent particle mesh ewald. Journal of Chemical Theory and Computation. 9 (9), 3878-3888 (2013).
- Berman, H. M., et al. The Protein Data Bank. Nucleic Acids Research. 28 (1), 235-242 (2000).
- Burley, S. K., et al. RCSB Protein Data Bank: Powerful new tools for exploring 3D structures of biological macromolecules for basic and applied research and education in fundamental biology, biomedicine, biotechnology, bioengineering and energy sciences. Nucleic Acids Research. 49, 437-451 (2021).
- Martinez, X., et al. Molecular graphics: Bridging structural biologists and computer scientists. Structure. 27 (11), 1617-1623 (2019).
- Lee, T. S., et al. GPU-accelerated molecular dynamics and free energy methods in Amber18: Performance enhancements and new features. Journal of Chemical Information and Modeling. 58 (10), 2043-2050 (2018).
- Jäger, R., Zwacka, R. M. The enigmatic roles of caspases in tumor development. Cancers. 2 (4), 1952-1979 (2010).
