分子モデリングアプローチによるカスパーゼ変異と翻訳後修飾の探索
Summary
本プロトコルは、生体分子シミュレーションパッケージを使用し、野生型カスパーゼおよびその変異形態をモデル化するための分子動力学(MD)アプローチを記載する。MD法は、カスパーゼ構造の動的進化および突然変異または翻訳後修飾の潜在的な影響を評価することを可能にする。
Abstract
アポトーシスは、損傷した細胞を排除し、多細胞生物の発生と組織の恒常性を制御するプログラムされた細胞死の一種です。システインプロテアーゼのファミリーであるカスパーゼは、アポトーシスの開始と実行において重要な役割を果たします。カスパーゼの成熟とその活性は、非常に動的な方法で翻訳後修飾によって微調整されます。翻訳後変化の影響を評価するために、潜在的な部位は、修飾に永続的な残基で日常的に変異されます。例えば、セリン残基はアラニンまたはアスパラギン酸で置換される。しかし、そのような置換はカスパーゼ活性部位の立体構造を変化させ、触媒活性および細胞機能の障害をもたらす可能性がある。さらに、重要な位置に位置する他のアミノ酸残基の突然変異もカスパーゼの構造と機能を破壊し、アポトーシス摂動を引き起こす可能性があります。変異残基を採用することの難しさを回避するために、分子モデリングアプローチを容易に適用して、カスパーゼ構造に対するアミノ酸置換の潜在的な影響を推定することができます。本プロトコルは、生物分子シミュレーションパッケージ(Amber)とスーパーコンピューター機能を使用して野生型カスパーゼとその変異型の両方をモデル化し、タンパク質の構造と機能に対する突然変異の影響をテストすることを可能にします。
Introduction
アポトーシスは、多細胞生物の形態形成と組織恒常性を調節する最も広く研究されている細胞プロセスの1つです。アポトーシスは、死受容体の活性化、細胞周期シグナルの乱れ、DNA損傷、小胞体(ER)ストレス、さまざまな細菌およびウイルス感染など、広範囲の外部または内部刺激によって開始される可能性があります1。カスパーゼ(主要なアポトーシスプレーヤー)は、ドメイン構造とカスパーゼカスケード2,3の場所に応じて、従来、イニシエーター(カスパーゼ-2、カスパーゼ-8、カスパーゼ-9、およびカスパーゼ-10)とエフェクター(カスパーゼ-3、カスパーゼ-6、およびカスパーゼ-7)の2つのグループに分類されます。細胞死シグナルにより、開始剤カスパーゼはアダプター分子と相互作用し、近接誘導二量体化および自動処理を促進して活性酵素を形成します。エフェクターカスパーゼは、開始剤カスパーゼによる切断を介して活性化され、複数の細胞基質4を切断することによって下流の実行ステップを実行する。
開始剤およびエフェクターカスパーゼの成熟および機能は、多数の異なる細胞内メカニズムによって調節されており、その中で翻訳後修飾は細胞死調節に不可欠な役割を果たす5。修飾基(リン酸化、ニトロシル化、メチル化、アセチル化)またはタンパク質(ユビキチン化またはSUMO化)の付加は、カスパーゼの酵素活性またはアポトーシスを調節するタンパク質の立体構造および安定性を変化させます。部位特異的突然変異誘発は、潜在的な翻訳後修飾部位を調査し、それらの役割を識別するために広く適用されています。推定修飾部位は通常、別のアミノ酸に置き換えられますが、これはさらに修飾することはできません。したがって、潜在的にリン酸化されたセリンおよびスレオニンはアラニンに変異し、リジンユビキチン化部位はアルギニンに置換される。別の戦略は、特に翻訳後修飾を模倣するアミノ酸を置換することを含む(例えば、リン酸化セリンまたはスレオニンを模倣するために使用されているグルタミン酸およびアスパラギン酸)6。しかし、活性部位の高い近傍または臨界位置に位置するこれらの置換のいくつかは、カスパーゼ構造を変化させ、触媒活性を乱し、アポトーシス細胞死を抑制する可能性があります7。同様の効果は、カスパーゼ遺伝子における腫瘍関連ミスセンス変異の場合にも観察され得る。例えば、カスパーゼ−6−R259H−の腫瘍関連変異は、基質結合ポケット内のループの立体構造変化をもたらし、基質8の効率的な触媒代謝回転を減少させた。頭頸部扁平上皮癌で同定されたカスパーゼ-8のG325Aアミノ酸置換は、カスパーゼ-8活性を阻害し、核因子-kB(NF-kB)シグナル伝達の調節につながり、腫瘍形成を促進しました9。
カスパーゼの構造と機能に対するアミノ酸置換の潜在的な影響を評価するために、分子モデリングを適用することができます。分子動力学(MD)アプローチは、生体分子シミュレーションパッケージ(Amber)を使用して野生型カスパーゼとその変異型をモデル化するためのこの研究で説明されています。MD法は、突然変異の導入後のタンパク質構造の動的進化のビューを提供します。もともとPeter Kollmanのグループによって開発されたAmberパッケージは、生体分子シミュレーション用の最も人気のあるソフトウェアツールの1つになりました10,11,12,13。このソフトウェアは2つの部分に分かれています:(1)AmberTools、システムの準備(原子タイプの割り当て、水素と明示的な水分子の追加など)と軌道分析に日常的に使用されるプログラムのコレクション。(2)pmemdシミュレーションプログラムを中心とするアンバー。AmberTools は無料のパッケージ (および Amber 自体をインストールするための前提条件) ですが、Amber は別のライセンスと料金体系で配布されます。スーパーコンピュータ上での並列シミュレーションやグラフィックスプロセッシングユニット(GPU)の使用により、タンパク質構造ダイナミクスの科学的研究のパフォーマンスを大幅に向上させることができます14。利用可能な最新のソフトウェアバージョンはAmberTools21とAmber20ですが、説明されているプロトコルは以前のバージョンでも使用できます。
Protocol
Representative Results
Discussion
記載されたMDアプローチは、生体分子シミュレーションパッケージを使用して、野生型および変異型の両方のカスパーゼをモデル化することを可能にする。ここでは、方法論のいくつかの重要な問題について説明します。まず、カスパーゼの代表的な結晶構造をタンパク質データバンクから選択する必要があります。重要なことに、カスパーゼの単量体および二量体形態の両方が許容される?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、ロシア科学財団(17-75-20102、プロトコル開発)からの助成金によってサポートされました。代表的な結果のセクション(リン酸化の分析)に記載されている実験は、ストックホルム(181301)およびスウェーデン(190345)癌協会によってサポートされました。
Materials
| Amber20 | University of California, San Francisco | Software for molecular dynamics simulation http://ambermd.org |
|
| AmberTools21 | University of California, San Francisco | Software for molecular modeling and analysis http://ambermd.org |
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