분자 모델링 접근법에 의한 Caspase 돌연변이 및 번역 후 변형 탐구
Summary
본 프로토콜은 생체 분자 시뮬레이션 패키지를 사용하고 야생형 카스파제 및 그 돌연변이 형태를 모델링하기 위한 분자 역학(MD) 접근법을 설명합니다. MD 방법은 카스파제 구조의 동적 진화와 돌연변이 또는 번역 후 변형의 잠재적 효과를 평가할 수 있습니다.
Abstract
세포 사멸은 손상된 세포를 제거하고 다세포 유기체의 발달 및 조직 항상성을 제어하는 프로그램 된 세포 사멸의 한 유형입니다. 시스테인 프로테아제 계열인 Caspases는 세포자멸사 개시 및 실행에 중요한 역할을 합니다. 카스파제의 성숙과 그 활성은 매우 역동적 인 방식으로 번역 후 수정에 의해 미세 조정됩니다. 번역 후 변화의 효과를 평가하기 위해, 잠재적 부위는 임의의 변형에 지속되는 잔기로 일상적으로 돌연변이된다. 예를 들어, 세린 잔기는 알라닌 또는 아스파르트 산으로 대체됩니다. 그러나, 이러한 치환은 카스파제 활성 부위의 형태를 변화시켜 촉매 활성 및 세포 기능의 장애를 초래할 수 있다. 더욱이, 중요한 위치에 위치한 다른 아미노산 잔기의 돌연변이는 또한 카스파제의 구조 및 기능을 파괴하고 세포 사멸 섭동을 유발할 수있다. 돌연변이된 잔기를 사용하는 어려움을 피하기 위해, 분자 모델링 접근법을 쉽게 적용하여 카스파제 구조에 대한 아미노산 치환의 잠재적 효과를 추정할 수 있다. 본 프로토콜은 단백질 구조 및 기능에 대한 돌연변이의 영향을 테스트하기 위해 생체 분자 시뮬레이션 패키지 (Amber) 및 슈퍼 컴퓨터 시설을 사용하여 야생형 카스파아제와 그 돌연변이 형태의 모델링을 허용합니다.
Introduction
세포 사멸은 다세포 유기체의 형태 형성 및 조직 항상성을 조절하는 가장 널리 연구 된 세포 과정 중 하나입니다. 아폽토시스는 사멸 수용체의 활성화, 세포주기 신호의 교란, DNA 손상, 소포체(ER) 스트레스, 및 다양한 박테리아 및 바이러스 감염과 같은 광범위한 외부 또는 내부 자극에 의해 개시될 수있다1. 주요 세포 사멸 선수 인 카스파제는 일반적으로 개시제 (카스파제 -2, 카스파제 -8, 카스파제 -9 및 카스파제 -10)와 이펙터 (카스파 제 -3, 카스파 제 -6 및 카스파 제 -7)의 두 그룹으로 분류되며, 도메인 구조와 카스파 아제 2,3의 위치에 따라 다릅니다. 세포 사멸 신호시, 개시제 카스파제는 활성 효소를 형성하기 위해 근접 유도 이량 체화 및 자동 처리를 촉진하는 어댑터 분자와 상호 작용합니다. 이펙터 카스파제는 개시제 카스파제에 의한 절단을 통해 활성화되고 다수의 세포기질을 절단하여 다운스트림 실행 단계를 수행합니다4.
개시제 및 이펙터 카스파제의 성숙 및 기능은 다수의 상이한 세포 내 메카니즘에 의해 조절되며, 그 중 번역 후 변형은 세포 사멸 조절에 없어서는 안될 역할을한다5. 변형기 (인산화, 니트로 실화, 메틸화 또는 아세틸 화) 또는 단백질 (유비퀴틴화 또는 SUMOylation)의 첨가는 카스파 제의 효소 활성 또는 세포 사멸을 조절하는 단백질 형태 및 안정성을 변화시킵니다. 부위 지향 돌연변이유발은 잠재적인 번역 후 변형 부위를 조사하고 그 역할을 식별하기 위해 널리 적용됩니다. 추정 변형 부위는 일반적으로 더 이상 변형 될 수없는 다른 아미노산으로 대체됩니다. 따라서, 잠재적으로 인산화 된 세린 및 트레오닌은 알라닌으로 돌연변이되고, 라이신 유비퀴틴 화 부위는 아르기닌으로 대체된다. 또 다른 전략은 특히 번역 후 변형을 모방하는 아미노산을 치환하는 것을 포함합니다 (예 : 글루타메이트 및 아스 파르 테이트는 인산화 된 세린 또는 트레오닌을 모방하는 데 사용되었습니다)6. 그러나, 활성 부위의 높은 부근 또는 임계 위치에 위치한 이들 치환 중 일부는 카스파제 구조를 변화시키고, 촉매 활성을 방해하며, 세포사멸세포 사멸을 억제할 수 있다7. 카스파제 유전자에서 종양 관련 미센스 돌연변이의 경우에도 유사한 효과가 관찰될 수 있습니다. 예를 들어, caspase-6 – R259H의 종양 관련 돌연변이는 기질 결합 포켓에서 루프의 구조적 변화를 초래하여 기질8의 효율적인 촉매 회전율을 감소시켰다. 두경부 편평 세포 암종에서 확인 된 카스파 제 -8의 G325A 아미노산 치환은 카스파 제 -8 활성을 방해 할 수 있으며, 이는 핵 인자 -kB (NF-kB) 신호 전달의 조절로 이어지고 종양 형성9를 촉진시켰다.
카스파아제 구조 및 기능에 대한 아미노산 치환의 잠재적 효과를 평가하기 위해, 분자 모델링이 적용될 수 있다. 분자 역학 (MD) 접근법은 생체 분자 시뮬레이션 패키지 (Amber)를 사용하여 야생형 카스파제 및 그 돌연변이 형태를 모델링하기 위해이 작업에 설명되어 있습니다. MD 방법은 돌연변이 도입 후 단백질 구조의 동적 진화에 대한 관점을 제공합니다. 원래 Peter Kollman의 그룹에서 개발한 Amber 패키지는 생체 분자 시뮬레이션10,11,12,13을 위한 가장 인기 있는 소프트웨어 도구 중 하나가 되었습니다. 이 소프트웨어는 두 부분으로 나뉩니다 : (1) AmberTools, 시스템 준비 (원자 유형 할당, 수소 및 명시 물 분자 추가 등) 및 궤적 분석에 일상적으로 사용되는 프로그램 모음; (2) pmemd 시뮬레이션 프로그램을 중심으로 한 앰버. AmberTools는 무료 패키지 (Amber 자체를 설치하기위한 전제 조건)이며 Amber는 별도의 라이센스 및 요금 구조로 배포됩니다. 슈퍼컴퓨터 상의 및/또는 그래픽 처리 유닛(GPU)을 사용하는 병렬 시뮬레이션은 단백질 구조 역학(14)의 과학적 연구를 위한 성능을 실질적으로 향상시킬 수 있다. 사용 가능한 최신 소프트웨어 버전은 AmberTools21 및 Amber20이지만 설명된 프로토콜을 이전 버전에서도 사용할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
설명된 MD 접근법은 생체분자 시뮬레이션 패키지를 사용하여 카스파아제의 야생형 및 돌연변이 형태를 모두 모델링할 수 있게 한다. 방법론의 몇 가지 중요한 문제가 여기에서 논의됩니다. 먼저, 카스파아제의 대표적인 결정구조는 단백질 데이터뱅크로부터 선택될 필요가 있다. 중요하게도, 단량체 및 이량 체 형태의 카스파아제가 모두 허용됩니다. 누락된 잔류물 수가 최소인 고해상도 구조를 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 러시아 과학 재단 (17-75-20102, 프로토콜 개발)의 보조금으로 지원되었습니다. 대표적인 결과 섹션(인산화 분석)에 설명된 실험은 스톡홀름(181301) 및 스웨덴(190345) 암 학회의 지원을 받았습니다.
Materials
| Amber20 | University of California, San Francisco | Software for molecular dynamics simulation http://ambermd.org |
|
| AmberTools21 | University of California, San Francisco | Software for molecular modeling and analysis http://ambermd.org |
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