Изучение мутаций каспазы и посттрансляционной модификации с помощью подходов молекулярного моделирования
Summary
Настоящий протокол использует пакет биомолекулярного моделирования и описывает подход молекулярной динамики (MD) для моделирования каспазы дикого типа и ее мутантных форм. Метод MD позволяет оценить динамическую эволюцию структуры каспазы и потенциальный эффект мутаций или посттрансляционных модификаций.
Abstract
Апоптоз — это тип запрограммированной гибели клеток, который устраняет поврежденные клетки и контролирует развитие и тканевой гомеостаз многоклеточных организмов. Caspases, семейство цистеиновых протеаз, играют ключевую роль в инициировании и выполнении апоптоза. Созревание каспаз и их активность тонко настраиваются посттрансляционными модификациями весьма динамичным образом. Чтобы оценить влияние посттрансляционных изменений, потенциальные участки обычно мутируют с остатками, устойчивыми к любым модификациям. Например, остаток серина заменяют аланином или аспарагиновой кислотой. Однако такие замены могут изменить конформацию активного центра каспазы, что приводит к нарушениям каталитической активности и клеточных функций. Более того, мутации других аминокислотных остатков, расположенных в критических положениях, также могут нарушать структуру и функции каспаз и приводить к возмущению апоптоза. Чтобы избежать трудностей с использованием мутировавших остатков, подходы молекулярного моделирования могут быть легко применены для оценки потенциального влияния замен аминокислот на структуру каспазы. Настоящий протокол позволяет моделировать как каспазу дикого типа, так и ее мутантные формы с помощью пакета биомолекулярного моделирования (Amber) и суперкомпьютерных средств для проверки влияния мутаций на структуру и функцию белка.
Introduction
Апоптоз является одним из наиболее широко изученных клеточных процессов, регулирующих морфогенез и тканевый гомеостаз многоклеточных организмов. Апоптоз может быть инициирован широким спектром внешних или внутренних стимулов, таких как активация рецепторов смерти, нарушение сигналов клеточного цикла, повреждение ДНК, стресс эндоплазматического ретикулума (ER) и различные бактериальные и вирусные инфекции1. Каспазы – ключевые апоптотические игроки – условно классифицируются на две группы: инициаторы (каспаза-2, каспаза-8, каспаза-9 и каспаза-10) и эффекторы (каспаза-3, каспаза-6 и каспаза-7), в зависимости от их доменной структуры и места в каскаде каспазы 2,3. По сигналам гибели клеток инициаторы каспазы взаимодействуют с молекулами-адапторами, которые облегчают димеризацию и автообработку, индуцированную близостью, с образованием активного фермента. Эффекторные каспазы активируются путем расщепления инициаторными каспазами и выполняют последующие этапы выполнения путем расщепления нескольких клеточных субстратов4.
Созревание и функция инициатора и эффекторной каспаз регулируются большим количеством различных внутриклеточных механизмов, среди которых посттрансляционная модификация играет незаменимую роль в модуляции гибели клеток5. Добавление модифицирующих групп (фосфорилирование, нитрозилирование, метилирование или ацетилирование) или белков (убиквитинирование или SUMOylation) изменяет ферментативную активность каспаз или конформацию и стабильность белка, которые регулируют апоптоз. Мутагенез, направленный на сайт, широко применяется для исследования потенциальных посттрансляционных модификационных сайтов и определения их роли. Предполагаемый сайт модификации обычно заменяется другой аминокислотой, которая не может быть дополнительно модифицирована. Таким образом, потенциально фосфорилированные серин и треонин мутируют в аланин, а места убиквитинирования лизина заменяются аргинином. Другая стратегия включает замену аминокислоты, которая особенно имитирует посттрансляционную модификацию (например, глутамат и аспартат использовались для имитации фосфорилированного серина или треонина)6. Однако некоторые из этих замен, расположенных в непосредственной близости от активного сайта или в критических положениях, могут изменять структуру каспазы, нарушать каталитическую активность и подавлять апоптотическую гибель клеток7. Аналогичные эффекты могут наблюдаться в случаях опухолеассоциированных мутаций в генах каспазы. Например, опухолеассоциированная мутация каспазы-6 – R259H – привела к конформационным изменениям петель в субстрат-связывающем кармане, уменьшая эффективный каталитический оборот субстратов8. Замена аминокислот G325A в каспазе-8, идентифицированная при плоскоклеточном раке головы и шеи, могла препятствовать активности каспазы-8, что приводило к модуляции передачи сигналов ядерного фактора kB (NF-kB) и способствовало опухолевому генезу9.
Для оценки потенциального влияния аминокислотных замен на структуру и функцию каспазы может быть применено молекулярное моделирование. Подход молекулярной динамики (MD) описан в этой работе для моделирования каспазы дикого типа и ее мутантных форм с использованием биомолекулярного пакета моделирования (Amber). Метод MD дает представление о динамической эволюции структуры белка после введения мутаций. Первоначально разработанный группой Питера Коллмана, пакет Amber стал одним из самых популярных программных инструментов для биомолекулярного моделирования 10,11,12,13. Это программное обеспечение разделено на две части: (1) AmberTools, набор программ, обычно используемых для подготовки системы (присвоение типа атома, добавление водорода и молекул эксплицитной воды и т. Д.) И анализа траектории; и (2) Янтарь, который сосредоточен вокруг программы моделирования pmemd. AmberTools является бесплатным пакетом (и обязательным условием для установки самого Amber), в то время как Amber распространяется с отдельной структурой лицензий и сборов. Параллельное моделирование на суперкомпьютере и/или с использованием графических процессоров (GPU) может существенно повысить производительность для научных исследований динамики структуры белка14. Последними доступными версиями программного обеспечения являются AmberTools21 и Amber20, но описанные протоколы также могут использоваться с предыдущими версиями.
Protocol
Representative Results
Discussion
Описанный подход MD позволяет моделировать как дикие, так и мутантные формы каспазы с использованием биомолекулярных пакетов моделирования. Здесь обсуждается несколько важных вопросов методологии. Во-первых, репрезентативная кристаллическая структура каспазы должна быть выбрана из ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грантом Российского научного фонда (17-75-20102, разработка протокола). Эксперименты, описанные в разделе репрезентативных результатов (анализ фосфорилирования), были поддержаны Стокгольмским (181301) и Шведским (190345) онкологическими обществами.
Materials
| Amber20 | University of California, San Francisco | Software for molecular dynamics simulation http://ambermd.org |
|
| AmberTools21 | University of California, San Francisco | Software for molecular modeling and analysis http://ambermd.org |
References
- Olsson, M., Zhivotovsky, B. Caspases and cancer. Cell Death and Differentiation. 18 (9), 1441-1449 (2011).
- Lavrik, I. N., Golks, A., Krammer, P. H. Caspase: Pharmacological manipulation of cell death. Journal of Clinical Investigation. 115 (10), 2665-2672 (2005).
- Degterev, A., Boyce, M., Yuan, J. A decade of caspases. Oncogene. 22 (53), 8543-8567 (2003).
- Pop, C., Salvesen, G. S. Human caspases: Activation, specificity, and regulation. Journal of Biological Chemistry. 284 (33), 21777-21781 (2009).
- Zamaraev, A. V., Kopeina, G. S., Prokhorova, E. A., Zhivotovsky, B., Lavrik, I. N. Post-translational modification of caspases: The other side of apoptosis regulation. Trends in Cell Biology. 27 (5), 322-339 (2017).
- Pearlman, S. M., Serber, Z., Ferrell, J. E. A mechanism for the evolution of phosphorylation sites. Cell. 147 (4), 934-946 (2011).
- Zamaraev, A. V., et al. Requirement for Serine-384 in Caspase-2 processing and activity. Cell Death and Disease. 11 (10), 825 (2020).
- Dagbay, K. B., Hill, M. E., Barrett, E., Hardy, J. A. Tumor-associated mutations in caspase-6 negatively impact catalytic efficiency. Biochemistry. 56 (34), 4568-4577 (2017).
- Ando, M., et al. Cancer-associated missense mutations of caspase-8 activate nuclear factor-κB signaling. Cancer Science. 104 (8), 1002-1008 (2013).
- Case, D. A., et al. . AMBER 2020. , (2020).
- Salomon-Ferrer, R., Case, D. A., Walker, R. C. An overview of the Amber biomolecular simulation package. WIREs Computational Molecular Science. 3 (2), 198-210 (2013).
- Roe, D. R., Cheatham, T. E. PTRAJ and CPPTRAJ: Software for processing and analysis of molecular dynamics trajectory data. Journal of Chemical Theory and Computation. 9 (7), 3084-3095 (2013).
- Maier, J. A., et al. ff14SB: Improving the accuracy of protein side chain and backbone parameters from ff99SB. Journal of Chemical Theory and Computation. 11 (8), 3696-3713 (2015).
- Salomon-Ferrer, R., Götz, A. W., Poole, D., Le Grand, S., Walker, R. C. Routine microsecond molecular dynamics simulations with AMBER on GPUs. 2. Explicit solvent particle mesh ewald. Journal of Chemical Theory and Computation. 9 (9), 3878-3888 (2013).
- Berman, H. M., et al. The Protein Data Bank. Nucleic Acids Research. 28 (1), 235-242 (2000).
- Burley, S. K., et al. RCSB Protein Data Bank: Powerful new tools for exploring 3D structures of biological macromolecules for basic and applied research and education in fundamental biology, biomedicine, biotechnology, bioengineering and energy sciences. Nucleic Acids Research. 49, 437-451 (2021).
- Martinez, X., et al. Molecular graphics: Bridging structural biologists and computer scientists. Structure. 27 (11), 1617-1623 (2019).
- Lee, T. S., et al. GPU-accelerated molecular dynamics and free energy methods in Amber18: Performance enhancements and new features. Journal of Chemical Information and Modeling. 58 (10), 2043-2050 (2018).
- Jäger, R., Zwacka, R. M. The enigmatic roles of caspases in tumor development. Cancers. 2 (4), 1952-1979 (2010).
