Onderzoek naar Caspase-mutaties en posttranslationele modificatie door moleculaire modelleringsbenaderingen
Summary
Het huidige protocol maakt gebruik van een biomoleculair simulatiepakket en beschrijft de moleculaire dynamica (MD) benadering voor het modelleren van het wild-type caspase en zijn mutante vormen. De MD-methode maakt het mogelijk om de dynamische evolutie van de caspasestructuur en het potentiële effect van mutaties of posttranslationele modificaties te beoordelen.
Abstract
Apoptose is een soort geprogrammeerde celdood die beschadigde cellen elimineert en de ontwikkeling en weefselhomeostase van meercellige organismen regelt. Caspasen, een familie van cysteïneproteasen, spelen een sleutelrol bij de initiatie en uitvoering van apoptose. De rijping van caspasen en hun activiteit wordt verfijnd door posttranslationele modificaties op een zeer dynamische manier. Om het effect van posttranslationele veranderingen te beoordelen, worden potentiële locaties routinematig gemuteerd met residuen die persistent zijn voor eventuele wijzigingen. Het serineresidu wordt bijvoorbeeld vervangen door alanine of asparaginezuur. Dergelijke substituties kunnen echter de conformatie van de caspase actieve site veranderen, wat leidt tot verstoringen in katalytische activiteit en cellulaire functies. Bovendien kunnen mutaties van andere aminozuurresiduen op kritieke posities ook de structuur en functies van caspasen breken en leiden tot apoptoseverstoring. Om de moeilijkheden van het gebruik van gemuteerde residuen te voorkomen, kunnen moleculaire modelleringsbenaderingen gemakkelijk worden toegepast om het potentiële effect van aminozuursubstituties op de caspasestructuur te schatten. Het huidige protocol maakt het modelleren van zowel het wild-type caspase als zijn mutante vormen mogelijk met het biomoleculaire simulatiepakket (Amber) en supercomputerfaciliteiten om het effect van mutaties op de eiwitstructuur en -functie te testen.
Introduction
Apoptose is een van de meest bestudeerde cellulaire processen die de morfogenese en weefselhomeostase van meercellige organismen reguleren. Apoptose kan worden geïnitieerd door een breed scala aan externe of interne stimuli, zoals de activering van doodsreceptoren, verstoring van de celcyclussignalen, DNA-schade, endoplasmatisch reticulum (ER) stress en verschillende bacteriële en virale infecties1. De caspasen – belangrijke apoptotische spelers – worden conventioneel ingedeeld in twee groepen: initiators (caspase-2, caspase-8, caspase-9 en caspase-10) en effectors (caspase-3, caspase-6 en caspase-7), afhankelijk van hun domeinstructuur en de plaats in de caspase cascade 2,3. Bij celdoodsignalen interageren de initiator caspases met adaptermoleculen die nabijheidsgeïnduceerde dimerisatie en autoprocessing vergemakkelijken om een actief enzym te vormen. De caspasen van de effector worden geactiveerd door splitsing door initiator caspasen en voeren stroomafwaartse uitvoeringsstappen uit door meerdere cellulaire substratente splitsen 4.
De rijping en functie van de initiator en effector caspasen worden gereguleerd door een groot aantal verschillende intracellulaire mechanismen, waaronder de posttranslationele modificatie een onmisbare rol speelt bij celdoodmodulatie5. De toevoeging van modificerende groepen (fosforylering, nitrosylering, methylatie of acetylering) of eiwitten (ubiquitinatie of SUMOylation) verandert de enzymatische activiteit van caspasen of de eiwitconformatie en stabiliteit die apoptose reguleren. Site-gerichte mutagenese wordt op grote schaal toegepast om de potentiële posttranslationele modificatiesites te onderzoeken en hun rol te onderscheiden. Een vermeende modificatieplaats wordt meestal vervangen door een ander aminozuur, dat niet verder kan worden gewijzigd. Zo worden potentieel gefosforyleerde serine en threonine gemuteerd tot alanine en worden lysine-ubiquitinatieplaatsen vervangen door arginine. Een andere strategie omvat het vervangen van een aminozuur dat met name posttranslationele modificatie nabootst (glutamaat en aspartaat zijn bijvoorbeeld gebruikt om gefosforyleerde serine of threonine na te bootsen)6. Sommige van deze substituties in de hoge omgeving van een actieve locatie of in kritieke posities kunnen echter de caspasestructuur veranderen, de katalytische activiteit verstoren en apoptotische celdood onderdrukken7. Vergelijkbare effecten kunnen worden waargenomen in gevallen van tumor-geassocieerde missense mutaties in caspase genen. De tumor-geassocieerde mutatie van caspase-6 – R259H – resulteerde bijvoorbeeld in conformatieveranderingen van lussen in de substraatbindende pocket, waardoor de efficiënte katalytische omzet van substratenwerd verminderd 8. De G325A-aminozuursubstitutie in caspase-8 geïdentificeerd in hoofd-hals plaveiselcelcarcinoom zou de caspase-8-activiteit kunnen belemmeren, wat leidde tot de modulatie van nucleaire factor-kB (NF-kB) signalering en tumorigenese bevorderde9.
Om het potentiële effect van aminozuursubstituties op de structuur en functie van caspase te beoordelen, kan moleculaire modellering worden toegepast. De moleculaire dynamica (MD) benadering wordt in dit werk beschreven voor het modelleren van het wild-type caspase en zijn mutante vormen met behulp van het biomoleculaire simulatiepakket (Amber). De MD-methode geeft een beeld van de dynamische evolutie van de eiwitstructuur na de introductie van mutaties. Oorspronkelijk ontwikkeld door de groep van Peter Kollman, werd het Amber-pakket een van de meest populaire softwaretools voor biomoleculaire simulaties 10,11,12,13. Deze software is verdeeld in twee delen: (1) AmberTools, een verzameling programma’s die routinematig worden gebruikt voor systeemvoorbereiding (atoomtypetoewijzing, toevoegen van waterstofatomen en expliciete watermoleculen, enz.) en trajectanalyse; en (2) Amber, dat is gecentreerd rond het pmemd-simulatieprogramma. AmberTools is een gratis pakket (en een voorwaarde voor het installeren van Amber zelf), terwijl Amber wordt gedistribueerd met een aparte licentie- en vergoedingsstructuur. Parallelle simulaties op een supercomputer en/of met behulp van grafische verwerkingseenheden (GPU’s) kunnen de prestaties voor het wetenschappelijk onderzoek naar eiwitstructuurdynamica aanzienlijk verbeteren14. De nieuwste beschikbare softwareversies zijn AmberTools21 en Amber20, maar de beschreven protocollen kunnen ook worden gebruikt met de vorige versies.
Protocol
Representative Results
Discussion
De beschreven MD-benadering maakt het mogelijk om zowel de wild-type als mutante vormen van caspase te modelleren met behulp van de biomoleculaire simulatiepakketten. Verschillende belangrijke kwesties van de methodologie worden hier besproken. Eerst moet een representatieve kristalstructuur van caspase worden geselecteerd uit de Protein Data Bank. Belangrijk is dat zowel monomere als dimerische vormen van caspase acceptabel zijn. Het kiezen van structuren met een hoge resolutie met een minimum aantal ontbrekende residue…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door een subsidie van de Russian Science Foundation (17-75-20102, de protocolontwikkeling). Experimenten beschreven in de sectie met representatieve resultaten (analyse van fosforylering) werden ondersteund door de Stockholm (181301) en Zweedse (190345) kankerverenigingen.
Materials
| Amber20 | University of California, San Francisco | Software for molecular dynamics simulation http://ambermd.org |
|
| AmberTools21 | University of California, San Francisco | Software for molecular modeling and analysis http://ambermd.org |
References
- Olsson, M., Zhivotovsky, B. Caspases and cancer. Cell Death and Differentiation. 18 (9), 1441-1449 (2011).
- Lavrik, I. N., Golks, A., Krammer, P. H. Caspase: Pharmacological manipulation of cell death. Journal of Clinical Investigation. 115 (10), 2665-2672 (2005).
- Degterev, A., Boyce, M., Yuan, J. A decade of caspases. Oncogene. 22 (53), 8543-8567 (2003).
- Pop, C., Salvesen, G. S. Human caspases: Activation, specificity, and regulation. Journal of Biological Chemistry. 284 (33), 21777-21781 (2009).
- Zamaraev, A. V., Kopeina, G. S., Prokhorova, E. A., Zhivotovsky, B., Lavrik, I. N. Post-translational modification of caspases: The other side of apoptosis regulation. Trends in Cell Biology. 27 (5), 322-339 (2017).
- Pearlman, S. M., Serber, Z., Ferrell, J. E. A mechanism for the evolution of phosphorylation sites. Cell. 147 (4), 934-946 (2011).
- Zamaraev, A. V., et al. Requirement for Serine-384 in Caspase-2 processing and activity. Cell Death and Disease. 11 (10), 825 (2020).
- Dagbay, K. B., Hill, M. E., Barrett, E., Hardy, J. A. Tumor-associated mutations in caspase-6 negatively impact catalytic efficiency. Biochemistry. 56 (34), 4568-4577 (2017).
- Ando, M., et al. Cancer-associated missense mutations of caspase-8 activate nuclear factor-κB signaling. Cancer Science. 104 (8), 1002-1008 (2013).
- Case, D. A., et al. . AMBER 2020. , (2020).
- Salomon-Ferrer, R., Case, D. A., Walker, R. C. An overview of the Amber biomolecular simulation package. WIREs Computational Molecular Science. 3 (2), 198-210 (2013).
- Roe, D. R., Cheatham, T. E. PTRAJ and CPPTRAJ: Software for processing and analysis of molecular dynamics trajectory data. Journal of Chemical Theory and Computation. 9 (7), 3084-3095 (2013).
- Maier, J. A., et al. ff14SB: Improving the accuracy of protein side chain and backbone parameters from ff99SB. Journal of Chemical Theory and Computation. 11 (8), 3696-3713 (2015).
- Salomon-Ferrer, R., Götz, A. W., Poole, D., Le Grand, S., Walker, R. C. Routine microsecond molecular dynamics simulations with AMBER on GPUs. 2. Explicit solvent particle mesh ewald. Journal of Chemical Theory and Computation. 9 (9), 3878-3888 (2013).
- Berman, H. M., et al. The Protein Data Bank. Nucleic Acids Research. 28 (1), 235-242 (2000).
- Burley, S. K., et al. RCSB Protein Data Bank: Powerful new tools for exploring 3D structures of biological macromolecules for basic and applied research and education in fundamental biology, biomedicine, biotechnology, bioengineering and energy sciences. Nucleic Acids Research. 49, 437-451 (2021).
- Martinez, X., et al. Molecular graphics: Bridging structural biologists and computer scientists. Structure. 27 (11), 1617-1623 (2019).
- Lee, T. S., et al. GPU-accelerated molecular dynamics and free energy methods in Amber18: Performance enhancements and new features. Journal of Chemical Information and Modeling. 58 (10), 2043-2050 (2018).
- Jäger, R., Zwacka, R. M. The enigmatic roles of caspases in tumor development. Cancers. 2 (4), 1952-1979 (2010).
