Utforske caspase mutasjoner og post-translasjonell modifikasjon ved molekylære modelleringsmetoder

Summary

Den nåværende protokollen bruker en biomolekylær simuleringspakke og beskriver molekylærdynamikken (MD) tilnærming for modellering av villtype caspase og dens mutante former. MD-metoden gjør det mulig å vurdere den dynamiske utviklingen av caspasestrukturen og den potensielle effekten av mutasjoner eller posttranslasjonelle modifikasjoner.

Abstract

Apoptose er en type programmert celledød som eliminerer skadede celler og styrer utviklingen og vevshomeostase av multicellulære organismer. Caspases, en familie av cysteinproteaser, spiller en nøkkelrolle i apoptoseinitiering og utførelse. Modningen av caspases og deres aktivitet er finjustert av posttranslasjonelle modifikasjoner på en svært dynamisk måte. For å vurdere effekten av posttranslasjonelle endringer, blir potensielle steder rutinemessig mutert med rester som er vedvarende for eventuelle modifikasjoner. For eksempel erstattes serinresten med alanin eller asparaginsyre. Slike substitusjoner kan imidlertid endre dannelsen av det aktive kaspasestedet, noe som kan føre til forstyrrelser i katalytisk aktivitet og cellulære funksjoner. Videre kan mutasjoner av andre aminosyrerester lokalisert i kritiske posisjoner også bryte strukturen og funksjonene til caspases og føre til apoptoseforstyrrelse. For å unngå vanskelighetene med å bruke muterte rester, kan molekylære modelleringsmetoder lett brukes til å estimere den potensielle effekten av aminosyresubstitusjoner på kaspasestrukturen. Den nåværende protokollen tillater modellering av både villtype-kaspase og dens mutantformer med biomolekylær simuleringspakke (Amber) og superdatamaskinfasiliteter for å teste effekten av mutasjoner på proteinstrukturen og funksjonen.

Introduction

Apoptose er en av de mest studerte cellulære prosessene som regulerer morfogenese og vevhomeostase av multicellulære organismer. Apoptose kan initieres av et bredt spekter av eksterne eller interne stimuli, for eksempel aktivering av dødsreseptorer, forstyrrelse i cellesyklussignalene, DNA-skade, endoplasmatisk retikulum (ER) stress og ulike bakterielle og^{virusinfeksjoner.} Caspases – viktige apoptotiske spillere – er konvensjonelt klassifisert i to grupper: initiatorer (caspase-2, caspase-8, caspase-9 og caspase-10) og effektorer (caspase-3, caspase-6 og caspase-7), avhengig av deres domenestruktur og stedet i caspase-kaskaden ^2,3. Ved celledødssignaler interagerer initiatorens caspases med adaptermolekyler som letter nærhetsindusert dimerisering og autoprosessering for å danne et aktivt enzym. Effektoren caspases aktiveres gjennom spaltning av initiator caspases og utfører nedstrøms utførelsestrinn ved å spalte flere cellulære substrater⁴.

Modningen og funksjonen til initiator- og effektor-caspasene reguleres av et stort antall forskjellige intracellulære mekanismer, blant annet den posttranslasjonelle modifikasjonen spiller en uunnværlig rolle i celledødsmodulasjon⁵. Tilsetningen av modifiserende grupper (fosforylering, nitrosylering, metylering eller acetylering) eller proteiner (ubiquitination eller SUMOylation) endrer den enzymatiske aktiviteten til caspases eller proteinkonformasjonen og stabiliteten som regulerer apoptose. Site-rettet mutagenese er mye brukt for å undersøke potensielle post-translasjonelle modifikasjonssteder og skille deres rolle. Et antatt modifikasjonssted erstattes vanligvis av en annen aminosyre, som ikke kan modifiseres ytterligere. Dermed blir potensielt fosforylert serin og treonin mutert til alanin, og lysin ubiquitination steder er erstattet med arginin. En annen strategi inkluderer å erstatte en aminosyre som spesielt etterligner posttranslasjonell modifikasjon (f.eks. glutamat og aspartat har blitt brukt til å etterligne fosforylert serin eller treonin)⁶. Noen av disse substitusjonene som befinner seg i nærheten av et aktivt sted eller i kritiske posisjoner, kan imidlertid endre kaspasestrukturen, forstyrre katalytisk aktivitet og undertrykke apoptotisk celledød⁷. Lignende effekter kan observeres i tilfeller av tumorassosierte missense-mutasjoner i caspase-gener. For eksempel resulterte den tumorassosierte mutasjonen av caspase-6 – R259H – i konformasjonsendringer av sløyfer i den substratbindende lommen, noe som reduserte den effektive katalytiske omsetningen av substrater⁸. G325A-aminosyresubstitusjonen i caspase-8 identifisert i hode- og nakkeplateepitelkarsinom kunne hemme caspase-8-aktivitet, noe som førte til modulering av nukleær faktor-kB (NF-kB) signalering og fremmet tumorigenese⁹.

For å vurdere den potensielle effekten av aminosyresubstitusjoner på caspase struktur og funksjon, kan molekylær modellering brukes. Den molekylære dynamikken (MD) tilnærmingen er beskrevet i dette arbeidet for modellering av villtype caspase og dens mutante former ved hjelp av biomolekylær simuleringspakke (Amber). MD-metoden gir et syn på den dynamiske utviklingen av proteinstrukturen etter innføring av mutasjoner. Opprinnelig utviklet av Peter Kollmans gruppe, ble Amber-pakken et av de mest populære programvareverktøyene for biomolekylære simuleringer^10,11,12,13. Denne programvaren er delt inn i to deler: (1) AmberTools, en samling av programmer som rutinemessig brukes til systemforberedelse (atomtypeoppgave, tilsetning av hydrogener og eksplisitte vannmolekyler, etc.) og baneanalyse; og (2) Amber, som er sentrert rundt pmemd-simuleringsprogrammet. AmberTools er en gratis pakke (og en forutsetning for å installere Amber selv), mens Amber distribueres med en egen lisens- og avgiftsstruktur. Parallelle simuleringer på en superdatamaskin og/eller ved hjelp av grafikkbehandlingsenheter (GPUer) kan forbedre ytelsen betydelig for vitenskapelig forskning av proteinstrukturdynamikk¹⁴. De siste tilgjengelige programvareversjonene er AmberTools21 og Amber20, men de beskrevne protokollene kan også brukes med de tidligere versjonene.

Protocol

1. Forberedelse av systemet MERK: De molekylære modellene av de innfødte og mutante proteinformene er bygget basert på en passende krystallstruktur hentet fra Protein Data Bank15,16. For å hente den valgte PDB-strukturen, bruk rullegardinlisten Last ned filer og klikk på PDB-format. Fjern merknader og tilkoblingsdata, og sett inn et TER-kort mellom separate proteinkjeder…

Representative Results

Denne protokollen kan lett anvendes i studier av posttranslasjonell modifisering av caspases eller patogene mutasjoner. I denne delen er MD-modelleringsarbeidsflyten illustrert (figur 1), som har blitt brukt med hell i studiet av caspase-27. Ved bruk av in vitro stedsrettet mutagenese av potensielle fosforyleringssteder (Ser/Thr til Ala) og biokjemiske tilnærminger ble det vist at Ser384Ala-mutasjonen forhindret caspase-2-prosessering og blokkerte enzymatisk…

Discussion

Den beskrevne MD-tilnærmingen gjør det mulig å modellere både villtype og mutante former for caspase ved hjelp av biomolekylære simuleringspakker. Flere viktige spørsmål ved metodikken diskuteres her. Først må en representativ krystallstruktur av caspase velges fra Protein Data Bank. Det er viktig at både monomere og dimeriske former for caspase er akseptable. Å velge høyoppløselige strukturer med et minimum antall manglende rester er en god idé. Protoneringstilstanden til noen rester kan stilles inn manuel…

Materials

Amber20	University of California, San Francisco		Software for molecular dynamics simulation http://ambermd.org
AmberTools21	University of California, San Francisco		Software for molecular modeling and analysis http://ambermd.org