Utforska kastasmutationer och post-translationell modifiering genom molekylära modelleringsmetoder
Summary
Detta protokoll använder ett biomolekylärt simuleringspaket och beskriver molekyldynamikmetoden (MD) för modellering av kaspaset av vild typ och dess mutanta former. MD-metoden gör det möjligt att bedöma den dynamiska utvecklingen av caspasestrukturen och den potentiella effekten av mutationer eller post-translationella modifieringar.
Abstract
Apoptos är en typ av programmerad celldöd som eliminerar skadade celler och kontrollerar utvecklingen och vävnadshomeostasen hos flercelliga organismer. Caspaser, en familj av cysteinproteaser, spelar en nyckelroll vid initiering och avrättning av apoptos. Mognaden av caspaser och deras aktivitet finjusteras av post-translationella modifieringar på ett mycket dynamiskt sätt. För att bedöma effekten av post-translationella förändringar muteras potentiella platser rutinmässigt med rester som är beständiga för eventuella modifieringar. Till exempel ersätts serinresten med alanin eller asparaginsyra. Sådana substitutioner kan emellertid förändra den kaspasaktiva platsens konformation, vilket leder till störningar i katalytisk aktivitet och cellulära funktioner. Dessutom kan mutationer av andra aminosyrarester som ligger i kritiska positioner också bryta strukturen och funktionerna hos kaspaser och leda till apoptosstörning. För att undvika svårigheterna med att använda muterade rester kan molekylära modelleringsmetoder lätt tillämpas för att uppskatta den potentiella effekten av aminosyrasubstitutioner på kaspasstrukturen. Detta protokoll tillåter modellering av både kaspaset av vildtyp och dess mutanta former med det biomolekylära simuleringspaketet (Amber) och superdatoranläggningar för att testa effekten av mutationer på proteinstrukturen och funktionen.
Introduction
Apoptos är en av de mest studerade cellulära processerna som reglerar morfogenesen och vävnadshomeostasen hos flercelliga organismer. Apoptos kan initieras av ett brett spektrum av yttre eller inre stimuli, såsom aktivering av dödsreceptorer, störningar i cellcykelsignalerna, DNA-skador, endoplasmatisk retikulum (ER) stress och olika bakteriella och virusinfektioner1. Caspaserna – viktiga apoptotiska spelare – klassificeras vanligtvis i två grupper: initiatorer (caspase-2, caspase-8, caspase-9 och caspase-10) och effektorer (caspase-3, caspase-6 och caspase-7), beroende på deras domänstruktur och platsen i caspase-kaskaden 2,3. Vid celldödssignaler interagerar initiatorkaspaserna med adaptermolekyler som underlättar närhetsinducerad dimerisering och autoprocessing för att bilda ett aktivt enzym. Effektorkaspaserna aktiveras genom klyvning av initiatorkaspaser och utför nedströms exekveringssteg genom att klyva flera cellulära substrat4.
Mognaden och funktionen hos initiator- och effektorkaspaserna regleras av ett stort antal olika intracellulära mekanismer, bland vilka den post-translationella modifieringen spelar en oumbärlig roll vid celldödsmodulering5. Tillsatsen av modifierande grupper (fosforylering, nitrosylering, metylering eller acetylering) eller proteiner (ubiquitination eller SUMOylation) förändrar den enzymatiska aktiviteten hos caspaser eller proteinkonformationen och stabiliteten som reglerar apoptos. Platsstyrd mutagenes används i stor utsträckning för att undersöka de potentiella post-translationella modifieringsplatserna och urskilja deras roll. En förmodad modifieringsplats ersätts vanligtvis av en annan aminosyra, som inte kan modifieras ytterligare. Således muteras potentiellt fosforylerat serin och treonin till alanin, och lysin ubiquitinationsställen ersätts med arginin. En annan strategi inkluderar att ersätta en aminosyra som särskilt efterliknar post-translationell modifiering (t.ex. glutamat och aspartat har använts för att efterlikna fosforylerat serin eller treonin)6. Några av dessa substitutioner som ligger i närheten av en aktiv plats eller i kritiska positioner kan emellertid förändra kaspasstrukturen, störa katalytisk aktivitet och undertrycka apoptotisk celldöd7. Liknande effekter kan observeras i fall av tumörassocierade missensemutationer i kaspasgener. Till exempel resulterade den tumörassocierade mutationen av caspase-6 – R259H – i konformationsförändringar av slingor i substratbindningsfickan, vilket minskade den effektiva katalytiska omsättningen av substrat8. G325A-aminosyrasubstitutionen i caspase-8 identifierad i skivepitelcancer i huvud och nacke kan hämma caspase-8-aktivitet, vilket ledde till modulering av kärnfaktor-kB (NF-kB) signalering och främjade tumorigenes9.
För att bedöma den potentiella effekten av aminosyrasubstitutioner på kaspasstruktur och funktion kan molekylär modellering tillämpas. Den molekylära dynamiken (MD) beskrivs i detta arbete för modellering av den vilda typen av kaspase och dess mutanta former med hjälp av det biomolekylära simuleringspaketet (Amber). MD-metoden ger en bild av den dynamiska utvecklingen av proteinstrukturen efter införandet av mutationer. Amber-paketet, som ursprungligen utvecklades av Peter Kollmans grupp, blev ett av de mest populära mjukvaruverktygen för biomolekylära simuleringar10,11,12,13. Denna programvara är uppdelad i två delar: (1) AmberTools, en samling program som rutinmässigt används för systemberedning (atomtypstilldelning, tillsats av väten och explicit-vattenmolekyler, etc.) och bananalys; och (2) Amber, som är centrerad kring simuleringsprogrammet pmemd. AmberTools är ett gratispaket (och en förutsättning för att installera Amber själv), medan Amber distribueras med en separat licens- och avgiftsstruktur. Parallella simuleringar på en superdator och/eller med grafikprocessorer (GPU: er) kan avsevärt förbättra prestandan för den vetenskapliga forskningen av proteinstrukturdynamik14. De senaste tillgängliga programvaruversionerna är AmberTools21 och Amber20, men de beskrivna protokollen kan också användas med de tidigare versionerna.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den beskrivna MD-metoden möjliggör modellering av både vildtyp och mutanta former av kaspase med hjälp av de biomolekylära simuleringspaketen. Flera viktiga frågor om metodiken diskuteras här. Först måste en representativ kristallstruktur av kaspas väljas från Protein Data Bank. Viktigt är att både monomera och dimeriska former av kaspas är acceptabla. Att välja högupplösta strukturer med ett minimalt antal saknade rester är en bra idé. Protoneringstillståndet för vissa rester kan ställas in manuell…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av ett bidrag från Russian Science Foundation (17-75-20102, protokollutvecklingen). Experiment som beskrivs i avsnittet representativa resultat (analys av fosforylering) stöddes av Stockholms (181301) och Sveriges (190345) cancerföreningar.
Materials
| Amber20 | University of California, San Francisco | Software for molecular dynamics simulation http://ambermd.org |
|
| AmberTools21 | University of California, San Francisco | Software for molecular modeling and analysis http://ambermd.org |
References
- Olsson, M., Zhivotovsky, B. Caspases and cancer. Cell Death and Differentiation. 18 (9), 1441-1449 (2011).
- Lavrik, I. N., Golks, A., Krammer, P. H. Caspase: Pharmacological manipulation of cell death. Journal of Clinical Investigation. 115 (10), 2665-2672 (2005).
- Degterev, A., Boyce, M., Yuan, J. A decade of caspases. Oncogene. 22 (53), 8543-8567 (2003).
- Pop, C., Salvesen, G. S. Human caspases: Activation, specificity, and regulation. Journal of Biological Chemistry. 284 (33), 21777-21781 (2009).
- Zamaraev, A. V., Kopeina, G. S., Prokhorova, E. A., Zhivotovsky, B., Lavrik, I. N. Post-translational modification of caspases: The other side of apoptosis regulation. Trends in Cell Biology. 27 (5), 322-339 (2017).
- Pearlman, S. M., Serber, Z., Ferrell, J. E. A mechanism for the evolution of phosphorylation sites. Cell. 147 (4), 934-946 (2011).
- Zamaraev, A. V., et al. Requirement for Serine-384 in Caspase-2 processing and activity. Cell Death and Disease. 11 (10), 825 (2020).
- Dagbay, K. B., Hill, M. E., Barrett, E., Hardy, J. A. Tumor-associated mutations in caspase-6 negatively impact catalytic efficiency. Biochemistry. 56 (34), 4568-4577 (2017).
- Ando, M., et al. Cancer-associated missense mutations of caspase-8 activate nuclear factor-κB signaling. Cancer Science. 104 (8), 1002-1008 (2013).
- Case, D. A., et al. . AMBER 2020. , (2020).
- Salomon-Ferrer, R., Case, D. A., Walker, R. C. An overview of the Amber biomolecular simulation package. WIREs Computational Molecular Science. 3 (2), 198-210 (2013).
- Roe, D. R., Cheatham, T. E. PTRAJ and CPPTRAJ: Software for processing and analysis of molecular dynamics trajectory data. Journal of Chemical Theory and Computation. 9 (7), 3084-3095 (2013).
- Maier, J. A., et al. ff14SB: Improving the accuracy of protein side chain and backbone parameters from ff99SB. Journal of Chemical Theory and Computation. 11 (8), 3696-3713 (2015).
- Salomon-Ferrer, R., Götz, A. W., Poole, D., Le Grand, S., Walker, R. C. Routine microsecond molecular dynamics simulations with AMBER on GPUs. 2. Explicit solvent particle mesh ewald. Journal of Chemical Theory and Computation. 9 (9), 3878-3888 (2013).
- Berman, H. M., et al. The Protein Data Bank. Nucleic Acids Research. 28 (1), 235-242 (2000).
- Burley, S. K., et al. RCSB Protein Data Bank: Powerful new tools for exploring 3D structures of biological macromolecules for basic and applied research and education in fundamental biology, biomedicine, biotechnology, bioengineering and energy sciences. Nucleic Acids Research. 49, 437-451 (2021).
- Martinez, X., et al. Molecular graphics: Bridging structural biologists and computer scientists. Structure. 27 (11), 1617-1623 (2019).
- Lee, T. S., et al. GPU-accelerated molecular dynamics and free energy methods in Amber18: Performance enhancements and new features. Journal of Chemical Information and Modeling. 58 (10), 2043-2050 (2018).
- Jäger, R., Zwacka, R. M. The enigmatic roles of caspases in tumor development. Cancers. 2 (4), 1952-1979 (2010).
