Kwantitatieve bepaling van de novo vetzuursynthese in bruin vetweefsel met behulp van deuteriumoxide

Summary

Hier presenteren we een goedkope kwantitatieve methode die gebruik maakt van deuteriumoxide en gaschromatografie massaspectrometrie (GCMS) voor de analyse van totaal vetzuur de novo lipogenese in bruin vetweefsel in vivo.

Abstract

Vetzuursynthese is een complexe en zeer energieverslindende metabole route met een belangrijke functionele rol bij de controle van de metabole homeostase van het hele lichaam en andere fysiologische en pathologische processen. In tegenstelling tot andere belangrijke metabole routes, zoals glucoseverwijdering, wordt de vetzuursynthese niet routinematig functioneel beoordeeld, wat leidt tot onvolledige interpretaties van de metabole status. Bovendien is er een gebrek aan openbaar beschikbare gedetailleerde protocollen die geschikt zijn voor nieuwkomers in het veld. Hier beschrijven we een goedkope kwantitatieve methode die gebruik maakt van deuteriumoxide en gaschromatografie massaspectrometrie (GCMS) voor de analyse van de novo synthese van totale vetzuren in bruin vetweefsel in vivo. Deze methode meet de synthese van de producten van vetzuursynthase onafhankelijk van een koolstofbron, en is potentieel nuttig voor vrijwel elk weefsel, in elk muismodel en onder elke externe verstoring. Details over de monstervoorbereiding voor GCMS en stroomafwaartse berekeningen worden verstrekt. We richten ons op de analyse van bruin vet vanwege de hoge niveaus van de novo vetzuursynthese en de cruciale rol bij het handhaven van metabole homeostase.

Introduction

Obesitas en bijbehorende stofwisselingsziekten zijn een pandemie die huidige en toekomstige generaties in gevaar brengt ^1,2. Algemeen vereenvoudigd als gevolg van de onbalans tussen energie-inname en -verbruik, beïnvloedt de metabole ontregeling die gepaard gaat met obesitas een groot aantal metabole routes die worden gecontroleerd door omgevings- en endogene^factoren3. Er zijn echter maar een paar routes die routinematig worden getest in diermodellen van metabole ontregeling.

De verwijdering van glucose wordt bijvoorbeeld routinematig gemeten door middel van glucose- en insulinetolerantietests, waarschijnlijk vanwege de eenvoud van het gebruik van draagbare glucosemeters⁴. De relatieve snelheid van glucose en lipide-oxidatie in het hele lichaam wordt ook routinematig geschat op basis van de respiratoire uitwisselingsratio van indirecte calorimetrietests ^5,6. De meeste andere aspecten van het metabolisme worden echter niet routinematig functioneel beoordeeld. Dit leidt tot onvolledige interpretaties van de metabole status en gemiste therapeutische opties. Een van de belangrijkste dergelijke routes is de novo lipogenese.

De novo lipogenese (DNL) is het proces waarbij nieuwe vetzuren worden gegenereerd uit voorlopers. Glucose wordt beschouwd als de belangrijkste precursor die bijdraagt aan DNL⁷ voor het hele lichaam, maar van andere precursoren, zoals acetaat, fructose, lactaat en aminozuren met vertakte ketens, is aangetoond dat ze relevante koolstofbronnen zijn op een ruimtelijke en conditieafhankelijke manier 8,9,10,11,12. DNL levert een belangrijke bijdrage aan de metabole homeostase en is essentieel voor een normale ontwikkeling¹³. Bovendien zijn veranderingen in DNL in verband gebracht met kanker 14,15 en metabole 16,17,18 en hart- en vaatziekten ^19,20.

De DNL-route bestaat uit de belangrijkste enzymatische componenten ATP-citraatlyase (ACLY), acetyl-CoA-carboxylase (ACC1/2) en vetzuursynthase (FAS) die voornamelijk palmitaat produceren, een verzadigd vetzuur met 16 koolstofatomen. Oneven ketens en vetzuren met vertakte ketens kunnen echter ook met lagere snelheden worden^{geproduceerd9}. Elongases en desaturasen modificeren deze vetzuren verder, waardoor een breed scala aan vetzuren ontstaat die nuttig zijn voor een verscheidenheid aan functies (bijv. energieopslag op lange termijn en manipulatie van de membraanvloeibaarheid).

De expressie van de DNL-enzymatische machinerie wordt gecontroleerd door een klein aantal transcriptiefactoren. De meest beschreven tot nu toe zijn de familie van sterolregulerende elementbindende eiwitten (SREBP), koolhydraatresponselementbindende eiwitten (ChREBP) en lever-X-receptoren (LXR)21,22,23,24,25,26. Ondanks een schijnbare overlapping in hun functies, zijn individuele regulaties op basis van celtypedominantie en fysiologische of pathologische aandoeningen gerapporteerd^21,22,27,28.

Opmerkelijk is dat een aantal remmers voor geselecteerde stappen van de DNL-route zijn goedgekeurd voor klinisch gebruik of zich in de preklinische of klinische ontwikkelingsstadia bevinden voor een aantal ziekten, waaronder obesitas, niet-alcoholische leververvetting/niet-alcoholische steatohepatitis (NAFLD/NASH) en hart- en^vaatziekten. Deze inspanningen onderstrepen de relevantie van DNL voor gezondheid en ziekte.

In de afgelopen jaren is het gebruik van methoden om de novo vetzuursynthese kwantitatief te beoordelen toegenomen³⁰. De meest gebruikelijke methode om dit te beoordelen is het gebruik van zwaar gelabeld water (D₂O), waarbij de zwaar gelabelde waterstof tijdens de synthese zowel direct als indirect wordt opgenomen in acylketens, via deuteriumuitwisseling met de waterstofatomen van de DNL-substraten NAPDH, acetyl-CoA en malonyl-CoA. Hoewel deze aanpak aan populariteit wint, is er een gebrek aan openbaar beschikbare gedetailleerde protocollen die geschikt zijn voor nieuwkomers in het veld. Hier schetsen we een methode voor het kwantitatief beoordelen van de de novo synthese van FAS-producten met behulp van D₂O en gaschromatografie massaspectrometrie (GCMS), met berekeningen die eerder zijn ontwikkeld door Lee et ^al.31. Deze methode meet de novo vetzuursynthese onafhankelijk van een koolstofbron, en is potentieel bruikbaar voor vrijwel elk weefsel, in elk muismodel en onder elke externe verstoring. Hier richten we ons op de analyse van bruin vetweefsel (BAT) vanwege de hoge niveaus van DNL en de cruciale rol bij het handhaven van metabole homeostase.

Protocol

Alle experimenten werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee van het Cincinnati Children’s Hospital Medical Center. 1. Bereiding van D2O OPMERKING: Om experimentele variatie te voorkomen, moet u voldoende oplossing/drinkwater bereiden voor alle muizen voor de duur van het experiment. Voor intraperitoneale injectie: genereer 0,9% w/v zoutoplossing D 2 O door 9 g NaCl op te lossen per liter D 2 O. Filtr…

Representative Results

Op basis van de D 2 O-dosering beschreven in stap 1, vinden we doorgaans dat lichaamswater wordt verrijkt in het bereik van2,5% tot 6%, en dat een basisniveau van deuteriumverrijking in lichaamswater snel wordt bereikt in 1 uur en gedurende de duur van het onderzoek wordt gehandhaafd via 8% verrijkt drinkwater (Figuur 1). Continue steady-state lichaamswaterverrijking is een aanname van de berekeningen die in stap 6 zijn gebruikt, en daarom raden we aan om de kinetiek van …

Discussion

Het begrijpen van de balans en interactie tussen complexe metabole routes is een onmisbare stap in de richting van het begrijpen van de biologische basis van metabole gerelateerde ziekten. Hier tonen we een niet-invasieve en goedkope methodologie om veranderingen in de novo vetzuursynthese te bepalen. Deze methode is gebaseerd op eerder gepubliceerde methoden die berekeningen ontwikkelden voor het schatten van de novo syntheseflux uit vetzuurdeuteriumverrijking³¹ en voor het gebr…

Materials

4 mL Glass Vials	Fisher Scientific	14-955-334
0.2 µm filter	Olympus Plastic	25-244
26G needeled syringes	BD	309597
Acetone	Merck	34850
Acetonitrile	Merck	900667
Blue GC screw cap with septa	Agilent	5190-1599
Centrifuge	Eppendorf	5424R
Chloroform	Sigma	366927
Deuterium oxide	Sigma	151882
Di-tert-butyl-4-methylphenol (BHT) Select FAME Column	Merck	B1378
Di-tert-butyl-4-methylphenol (BHT) Select FAME Column	Agilent	CP7419
EDTA tube	Sarstedt	411395105
Ethanol	Merck	51976
Hexadecenoic-d31 Acid	Larodan	71-1631
Hexane	Merck	34859
Methanol	Merck	34860
Microcentrifuge tube	Olympus Plastic	24-282
Mouse environmental chamber	Caron	Caron 7001-33
Potasium Chloride	Fisher Bioreagents	BP366-500
Potasium Phosphate	MP Biomedicals	194727
SafeLock microcentrifuge tubes	Eppendorf	30120086
Screw top amber GC vial	Agilent	5182-0716
Sodium Chloride	Fisher Bioreagents	BP358-212
Sodium Hydroxide	Merck	S5881
Sodium Phosphate, dibasic	Fisher Bioreagents	BP332-500
Sodium Sulfate	Merck	239313
Sulfuric Acid	Merck	258105
Vial insert	Agilent	5183-2088