JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biology

Количественное определение de novo синтеза жирных кислот в бурой жировой ткани с использованием оксида дейтерия

Published: May 12, 2023
doi:
10.3791/64219
, , ,
1UCD Conway Institute and UCD Institute of Food and Health, School of Agriculture and Food Science,University College Dublin, 2Division of Endocrinology,Cincinnati Children’s Hospital Medical Center, Cincinnati, 3Division of Developmental Biology,Cincinnati Children’s Hospital Medical Center, Cincinnati, 4Department of Pediatrics,University of Cincinnati College of Medicine

Summary

Здесь мы представляем недорогой количественный метод с использованием масс-спектрометрии оксида дейтерия и газовой хроматографии (GCMS) для анализа общего липогенеза жирных кислот de novo в бурой жировой ткани in vivo.

Abstract

Синтез жирных кислот является сложным и энергозатратным метаболическим путем, играющим важную функциональную роль в контроле метаболического гомеостаза всего организма и других физиологических и патологических процессов. В отличие от других ключевых метаболических путей, таких как утилизация глюкозы, синтез жирных кислот обычно функционально не оценивается, что приводит к неполной интерпретации метаболического статуса. Кроме того, в открытом доступе отсутствуют подробные протоколы, подходящие для новичков в этой области. В данной статье мы опишем недорогой количественный метод, использующий масс-спектрометрию оксида дейтерия и газовую хроматографию (GCMS) для анализа общего синтеза жирных кислот de novo в бурой жировой ткани in vivo. Этот метод измеряет синтез продуктов синтазы жирных кислот независимо от источника углерода, и он потенциально полезен практически для любой ткани, в любой мышиной модели и при любых внешних возмущениях. Приведена подробная информация о подготовке образцов для GCMS и последующих расчетах. Мы фокусируемся на анализе бурого жира из-за его высокого уровня синтеза жирных кислот de novo и критической роли в поддержании метаболического гомеостаза.

Introduction

Ожирение и связанные с ним метаболические заболевания представляют собой пандемию, которая угрожает нынешнему и будущим поколениям 1,2. Метаболическая дисрегуляция, связанная с ожирением, обычно упрощается как следствие дисбаланса между потреблением и расходом энергии, затрагивает большое количество метаболических путей, контролируемых факторами окружающей среды и эндогеннымифакторами. Тем не менее, только несколько путей регулярно тестируются на животных моделях метаболической дисрегуляции.

Например, утилизация глюкозы обычно измеряется с помощью тестов на глюкозу и толерантность к инсулину, вероятно, из-за простоты использования портативных глюкометров4. Относительные скорости окисления глюкозы и липидов во всем организме также обычно оцениваются на основе коэффициента дыхательного обмена по данным непрямых калориметрических анализов 5,6. Тем не менее, большинство других аспектов метаболизма обычно не оцениваются функционально. Это приводит к неполной интерпретации метаболического статуса и упущенным терапевтическим возможностям. Одним из основных таких путей является липогенез de novo.

Липогенез de novo (DNL) — это процесс, с помощью которого из предшественников образуются новые жирные кислоты. Глюкоза считается основным прекурсором, способствующим ДНЛ7 всего тела, однако было показано, что другие предшественники, такие как ацетат, фруктоза, лактат и аминокислоты с разветвленной цепью, являются важными источниками углерода в зависимости от пространстве и состояния 8,9,10,11,12. ДНЛ является ключевым фактором, влияющим на метаболический гомеостаз, и имеет важное значение для нормального развития13. Кроме того, изменения в DNL были связаны с раком14,15 и метаболическими 16,17,18 и сердечно-сосудистыми заболеваниями 19,20.

Путь DNL состоит из основных ферментативных компонентов АТФ-цитратлиазы (ACLY), ацетил-КоА-карбоксилазы (ACC1/2) и синтазы жирных кислот (FAS), которые в основном продуцируют пальмитат, 16-углеродную насыщенную жирную кислоту. Тем не менее, жирные кислоты с нечетной и разветвленной цепью также могут производиться с более низкими показателями. Элонгазы и десатуразы дополнительно модифицируют эти жирные кислоты, создавая разнообразный спектр видов жирных кислот, полезных для различных функций (например, долгосрочное хранение энергии и манипулирование текучестью мембраны).

Экспрессия ферментативного аппарата DNL контролируется небольшим числом транскрипционных факторов. Наиболее хорошо описанными на сегодняшний день являются семейство белка, связывающего регуляторные элементы стерола (SREBP), белок, связывающий элемент углеводного ответа (ChREBP) и Х-рецептор печени (LXR)21,22,23,24,25,26. Несмотря на кажущееся совпадение их функций, сообщалось об индивидуальных регуляциях, основанных на доминировании типа клеток и физиологических или патологических состояниях21,22,27,28.

Примечательно, что ряд ингибиторов для отдельных этапов пути ДНЛ были одобрены для клинического использования или находятся на доклинической или клинической стадии разработки для ряда заболеваний, включая ожирение, неалкогольную жировую болезнь печени/неалкогольный стеатогепатит (НАЖБП/НАСГ) и сердечно-сосудистые заболевания29. Эти усилия подчеркивают актуальность DNL для здоровья и болезней.

В последние годы использование методов количественной оценки синтеза жирных кислот de novo возрослов 30 раз. Наиболее распространенным методом оценки этого является использование тяжелой меченой воды (D2O), где тяжелый меченый водород включается в ацильные цепи во время синтеза как прямо, так и косвенно, посредством обмена дейтерия с водородами субстратов DNL NAPDH, ацетил-КоА и малонил-КоА. Несмотря на то, что этот подход набирает популярность, в открытом доступе не хватает подробных протоколов, подходящих для новичков в этой области. В данной работе мы излагаем метод количественной оценки de novo синтеза продуктов ФАС с использованием D2O и газовой хроматографической масс-спектрометрии (GCMS) с расчетами, ранее разработанными Lee et al.31. Этот метод измеряет синтез жирных кислот de novo независимо от источника углерода, и он потенциально полезен практически для любой ткани, в любой модели мыши и при любых внешних возмущениях. Здесь мы сосредоточимся на анализе бурой жировой ткани (BAT) из-за ее высокого уровня DNL и критической роли в поддержании метаболического гомеостаза.

Protocol

Все эксперименты были одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию в Медицинском центре детской больницы Цинциннати. 1. ПриготовлениеД2О ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы избежать отклонений в эксперименте, приготовьте достаточное количеств…

Representative Results

Основываясь на дозировкеD2O, описанной на этапе 1, мы обычно обнаруживаем, что вода в организме обогащается в диапазоне от 2,5% до 6%, и что исходный уровень обогащения дейтерия в воде организма быстро достигается через 1 ч и поддерживается в течение всего исследования с помощью пи…

Discussion

Понимание баланса и взаимодействия между сложными метаболическими путями является необходимым шагом на пути к пониманию биологической основы заболеваний, связанных с обменом веществ. Здесь мы демонстрируем неинвазивную и недорогую методологию определения изменений в синтезе жирны?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы благодарим сотрудников лаборатории Санчес-Гурмачес и Уоллеса за ценные обсуждения. Эта работа была поддержана грантами Американской кардиологической ассоциации (18CDA34080527 для JSG и 19POST34380545 для RM), NIH (R21OD031907 для JSG), CCHMC Trustee Award, CCHMC Center for Pediatric Genomics Award и CCHMC Center for Mendelian Genomics & Therapeutics Award. Эта работа была частично поддержана NIH P30 DK078392 Центра исследований заболеваний пищеварительной системы в Цинциннати. Содержание является исключительной ответственностью авторов и не обязательно отражает официальную точку зрения Национальных институтов здравоохранения. RT и MW были поддержаны стипендиальной программой UCD Ad Astra Fellowship.

Materials

4 mL Glass Vials Fisher Scientific 14-955-334
0.2 µm filter Olympus Plastic 25-244
26G needeled syringes BD 309597
Acetone Merck 34850
Acetonitrile Merck 900667
Blue GC screw cap with septa Agilent 5190-1599
Centrifuge Eppendorf 5424R
Chloroform Sigma 366927
Deuterium oxide Sigma 151882
Di-tert-butyl-4-methylphenol (BHT)
Select FAME Column		 Merck B1378
Di-tert-butyl-4-methylphenol (BHT)
Select FAME Column		 Agilent CP7419
EDTA tube Sarstedt 411395105
Ethanol Merck 51976
Hexadecenoic-d31 Acid Larodan 71-1631
Hexane Merck 34859
Methanol Merck 34860
Microcentrifuge tube Olympus Plastic 24-282
Mouse environmental chamber Caron Caron 7001-33
Potasium Chloride Fisher Bioreagents BP366-500
Potasium Phosphate MP Biomedicals 194727
SafeLock microcentrifuge tubes Eppendorf 30120086
Screw top amber GC vial Agilent 5182-0716
Sodium Chloride Fisher Bioreagents BP358-212
Sodium Hydroxide Merck S5881
Sodium Phosphate, dibasic Fisher Bioreagents BP332-500
Sodium Sulfate Merck 239313
Sulfuric Acid Merck 258105
Vial insert Agilent 5183-2088
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. . The Lancet, Diabetes Endocrinology. Childhood obesity: a growing pandemic. The Lancet. Diabetes & Endocrinology. 10 (1), 1 (2022).
  2. Gonzalez-Muniesa, P., et al. Obesity. Nature Reviews Disease Primers. 3, 17034 (2017).
  3. Müller, T. D., Blüher, M., Tschöp, M. H., DiMarchi, R. D. Anti-obesity drug discovery: advances and challenges. Nature Reviews Drug Discovery. 21 (3), 201-223 (2021).
  4. Virtue, S., Vidal-Puig, A. GTTs and ITTs in mice: simple tests, complex answers. Nature Metabolism. 3 (7), 883-886 (2021).
  5. Müller, T. D., Klingenspor, M., Tschöp, M. H. Revisiting energy expenditure: how to correct mouse metabolic rate for body mass. Nature Metabolism. 3 (9), 1134-1136 (2021).
  6. Virtue, S., Lelliott, C. J., Vidal-Puig, A. What is the most appropriate covariate in ANCOVA when analysing metabolic rate. Nature Metabolism. 3 (12), 1585 (2021).
  7. Hellerstein, M. K. De novo lipogenesis in humans: metabolic and regulatory aspects. European Journal of Clinical Nutrition. 53 Suppl 1, S53-S65 (1999).
  8. Zhao, S., et al. Dietary fructose feeds hepatic lipogenesis via microbiota-derived acetate. Nature. 579 (7800), 586-591 (2020).
  9. Wallace, M., et al. Enzyme promiscuity drives branched-chain fatty acid synthesis in adipose tissues. Nature Chemical Biology. 14 (11), 1021-1031 (2018).
  10. Zhao, S., et al. ATP-citrate lyase controls a glucose-to-acetate metabolic switch. Cell Reports. 17 (4), 1037-1052 (2016).
  11. Green, C. R., et al. Branched-chain amino acid catabolism fuels adipocyte differentiation and lipogenesis. Nature Chemical Biology. 12 (1), 15-21 (2016).
  12. Zhang, Z., et al. Serine catabolism generates liver NADPH and supports hepatic lipogenesis. Nature Metabolism. 3 (12), 1608-1620 (2021).
  13. Chirala, S. S., et al. Fatty acid synthesis is essential in embryonic development: fatty acid synthase null mutants and most of the heterozygotes die in utero. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (11), 6358-6363 (2003).
  14. Icard, P., et al. ATP citrate lyase: A central metabolic enzyme in cancer. Cancer Letters. 471, 125-134 (2020).
  15. Fhu, C. W., Ali, A. Fatty acid synthase: an emerging target in cancer. Molecules. 25 (17), 3935 (2020).
  16. Lawitz, E. J., et al. Acetyl-CoA carboxylase inhibitor GS-0976 for 12 weeks reduces hepatic de novo lipogenesis and steatosis in patients with nonalcoholic steatohepatitis. Clinical Gastroenterology and Hepatology. 16 (12), 1983e3-1991e3 (2018).
  17. Smith, G. I., et al. Insulin resistance drives hepatic de novo lipogenesis in nonalcoholic fatty liver disease. The Journal of Clinical Investigation. 130 (3), 1453-1460 (2020).
  18. Imamura, F., et al. Fatty acids in the de novo lipogenesis pathway and incidence of type 2 diabetes: A pooled analysis of prospective cohort studies. PLoS Medicine. 17 (6), e1003102 (2020).
  19. Lai, H. T. M., et al. Serial plasma phospholipid fatty acids in the de novo lipogenesis pathway and total mortality, cause-specific mortality, and cardiovascular diseases in the cardiovascular health study. Journal of the American Heart Association. 8 (22), e012881 (2019).
  20. Ference, B. A., et al. Mendelian randomization study of ACLY and cardiovascular disease. The New England Journal of Medicine. 380 (11), 1033-1042 (2019).
  21. Herman, M. A., et al. A novel ChREBP isoform in adipose tissue regulates systemic glucose metabolism. Nature. 484 (7394), 333-338 (2012).
  22. Sanchez-Gurmaches, J., et al. Brown fat AKT2 Is a cold-induced kinase that stimulates ChREBP-mediated de novo lipogenesis to optimize fuel storage and thermogenesis. Cell Metabolism. 27 (1), 195e6-209e6 (2018).
  23. Wang, X., et al. Nuclear protein that binds sterol regulatory element of low density lipoprotein receptor promoter. II. Purification and characterization. The Journal of Biological Chemistry. 268 (19), 14497-14504 (1993).
  24. Briggs, M. R., Yokoyama, C., Wang, X., Brown, M. S., Goldstein, J. L. Nuclear protein that binds sterol regulatory element of low density lipoprotein receptor promoter. I. Identification of the protein and delineation of its target nucleotide sequence. The Journal of Biological Chemistry. 268 (19), 14490-14496 (1993).
  25. Yokoyama, C., et al. SREBP-1, a basic-helix-loop-helix-leucine zipper protein that controls transcription of the low density lipoprotein receptor gene. Cell. 75 (1), 187-197 (1993).
  26. Chen, G., Liang, G., Ou, J., Goldstein, J. L., Brown, M. S. Central role for liver X receptor in insulin-mediated activation of Srebp-1c transcription and stimulation of fatty acid synthesis in liver. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (31), 11245-11250 (2004).
  27. Denechaud, P. D., et al. ChREBP, but not LXRs, is required for the induction of glucose-regulated genes in mouse liver. The Journal of Clinical Investigation. 118 (3), 956-964 (2008).
  28. Crewe, C., et al. SREBP-regulated adipocyte lipogenesis is dependent on substrate availability and redox modulation of mTORC1. JCI Insight. 5 (15), e129397 (2019).
  29. Batchuluun, B., Pinkosky, S. L., Steinberg, G. R. Lipogenesis inhibitors: therapeutic opportunities and challenges. Nature Reviews Drug Discovery. 21 (4), 283-305 (2022).
  30. Wallace, M., Metallo, C. M. Tracing insights into de novo lipogenesis in liver and adipose tissues. Seminars in Cell & Developmental Biology. 108, 65-71 (2020).
  31. Lee, W. N., et al. In vivo measurement of fatty acids and cholesterol synthesis using D2O and mass isotopomer analysis. The American Journal of Physiology. 266 (5 Pt 1), E699-E708 (1994).
  32. Yao, C. H., Liu, G. Y., Yang, K., Gross, R. W., Patti, G. J. Inaccurate quantitation of palmitate in metabolomics and isotope tracer studies due to plastics. Metabolomics. 12, 143 (2016).
  33. Hiller, K., et al. MetaboliteDetector: comprehensive analysis tool for targeted and nontargeted GC/MS based metabolome analysis. Analytical Chemistry. 81 (9), 3429-3439 (2009).
  34. Fernandez, C. A., Des Rosiers, C., Previs, S. F., David, F., Brunengraber, H. Correction of 13C mass isotopomer distributions for natural stable isotope abundance. Journal of Mass Spectrometry. 31 (3), 255-262 (1996).
  35. Midani, F. S., Wynn, M. L., Schnell, S. The importance of accurately correcting for the natural abundance of stable isotopes. Analytical Biochemistry. 520, 27-43 (2017).
  36. Trefely, S., Ashwell, P., Snyder, N. W. FluxFix: automatic isotopologue normalization for metabolic tracer analysis. BMC Bioinformatics. 17 (1), 485 (2016).
  37. Jeong, H., et al. Correcting for naturally occurring mass isotopologue abundances in stable-isotope tracing experiments with PolyMID. Metabolites. 11 (5), 310 (2021).
  38. Millard, P., et al. IsoCor: isotope correction for high-resolution MS labeling experiments. Bioinformatics. 35 (21), 4484-4487 (2019).
  39. Brunengraber, D. Z., et al. Influence of diet on the modeling of adipose tissue triglycerides during growth. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolsim. 285 (4), E917-E925 (2003).
  40. Svensson, R. U., et al. Inhibition of acetyl-CoA carboxylase suppresses fatty acid synthesis and tumor growth of non-small-cell lung cancer in preclinical models. Nature Medicine. 22 (10), 1108-1119 (2016).
  41. Hellerstein, M. K., Neese, R. A. Mass isotopomer distribution analysis: a technique for measuring biosynthesis and turnover of polymers. The American Journal of Physiology. 263 (5 Pt 1), E988-E1001 (1992).
  42. Hellerstein, M. K., Neese, R. A. Mass isotopomer distribution analysis at eight years: theoretical, analytic, and experimental considerations. The American Journal of Physiology. 276 (6), E1146-E1170 (1999).
  43. Kelleher, J. K., Masterson, T. M. Model equations for condensation biosynthesis using stable isotopes and radioisotopes. The American Journal of Physiology. 262 (1 Pt 1), E118-E125 (1992).
  44. Kelleher, J. K., Nickol, G. B. Isotopomer spectral analysis: utilizing nonlinear models in isotopic flux studies. Methods in Enzymology. 561, 303-330 (2015).
  45. Argus, J. P., et al. Development and application of FASA, a model for quantifying fatty acid metabolism using stable isotope labeling. Cell Reports. 25 (10), 2919.e8-2934.e8 (2018).
  46. Guilherme, A., et al. Control of adipocyte thermogenesis and lipogenesis through β3-adrenergic and thyroid hormone signal integration. Cell Reports. 31 (5), 107598 (2020).
  47. Guilherme, A., et al. Neuronal modulation of brown adipose activity through perturbation of white adipocyte lipogenesis. Molecular Metabolism. 16, 116-125 (2018).
  48. Guilherme, A., et al. Adipocyte lipid synthesis coupled to neuronal control of thermogenic programming. Molecular Metabolism. 6 (8), 781-796 (2017).
  49. Lodhi, I. J., et al. Inhibiting adipose tissue lipogenesis reprograms thermogenesis and PPARgamma activation to decrease diet-induced obesity. Cell Metabolism. 16 (2), 189-201 (2012).
  50. McCormack, J. G., Denton, R. M. Evidence that fatty acid synthesis in the interscapular brown adipose tissue of cold-adapted rats is increased in vivo by insulin by mechanisms involving parallel activation of pyruvate dehydrogenase and acetyl-coenzyme A carboxylase. The Biochemistry Journal. 166 (3), 627-630 (1977).
  51. Trayhurn, P. Fatty acid synthesis in vivo in brown adipose tissue, liver and white adipose tissue of the cold-acclimated rat. FEBS Letters. 104 (1), 13-16 (1979).
  52. Negron, S. G., Ercan-Sencicek, A. G., Freed, J., Walters, M., Lin, Z. Both proliferation and lipogenesis of brown adipocytes contribute to postnatal brown adipose tissue growth in mice. Science Reports. 10 (1), 20335 (2020).
  53. Schlein, C., et al. Endogenous fatty acid synthesis drives brown adipose tissue involution. Cell Reports. 34 (2), 108624 (2021).
  54. Mottillo, E. P., et al. Coupling of lipolysis and de novo lipogenesis in brown, beige, and white adipose tissues during chronic beta3-adrenergic receptor activation. Journal of Lipid Research. 55 (11), 2276-2286 (2014).
  55. Adlanmerini, M., et al. Circadian lipid synthesis in brown fat maintains murine body temperature during chronic cold. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (37), 18691-18699 (2019).
  56. Yu, X. X., Lewin, D. A., Forrest, W., Adams, S. H. Cold elicits the simultaneous induction of fatty acid synthesis and beta-oxidation in murine brown adipose tissue: prediction from differential gene expression and confirmation in vivo. FASEB Journal. 16 (2), 155-168 (2002).
  57. Kushner, D. J., Baker, A., Dunstall, T. G. Pharmacological uses and perspectives of heavy water and deuterated compounds. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 77 (2), 79-88 (1999).
  58. Diraison, F., Pachiaudi, C., Beylot, M. Measuring lipogenesis and cholesterol synthesis in humans with deuterated water: use of simple gas chromatographic/mass spectrometric techniques. Journal of Mass Spectrometry. 32 (1), 81-86 (1997).
  59. Yang, D., et al. Assay of low deuterium enrichment of water by isotopic exchange with [U-13C3]acetone and gas chromatography-mass spectrometry. Analytical Biochemistry. 258 (2), 315-321 (1998).
  60. Fu, X., et al. Measurement of lipogenic flux by deuterium resolved mass spectrometry. Nature Communications. 12 (1), 3756 (2021).
  61. Shah, V., Herath, K., Previs, S. F., Hubbard, B. K., Roddy, T. P. Headspace analyses of acetone: a rapid method for measuring the 2H-labeling of water. Analytical Biochemistry. 404 (2), 235-237 (2010).
  62. Argus, J. P., Yu, A. K., Wang, E. S., Williams, K. J., Bensinger, S. J. An optimized method for measuring fatty acids and cholesterol in stable isotope-labeled cells. Journal of Lipid Research. 58 (2), 460-468 (2017).
  63. Belew, G. D., Jones, J. G. De novo lipogenesis in non-alcoholic fatty liver disease: Quantification with stable isotope tracers. European Journal of Clinical Investigation. 52 (3), e13733 (2022).
  64. Zhang, Z., Chen, L., Liu, L., Su, X., Rabinowitz, J. D. Chemical basis for deuterium labeling of fat and NADPH. Journal of the American Chemical Society. 139 (41), 14368-14371 (2017).
  65. Belew, G. D., et al. Transfer of glucose hydrogens via acetyl-CoA, malonyl-CoA, and NADPH to fatty acids during de novo lipogenesis. Journal of Lipid Research. 60 (12), 2050-2056 (2019).
  66. Diraison, F., Pachiaudi, C., Beylot, M. In vivo measurement of plasma cholesterol and fatty acid synthesis with deuterated water: determination of the average number of deuterium atoms incorporated. Metabolism. 45 (7), 817-821 (1996).
  67. Ajie, H. O., et al. In vivo study of the biosynthesis of long-chain fatty acids using deuterated water. The American Journal of Physiology. 269 (2 Pt 1), E247-E252 (1995).
  68. Schloerb, P. R., Friis-Hansen, B. J., Edelman, I. S., Solomon, A. K., Moore, F. D. The measurement of total body water in the human subject by deuterium oxide dilution; with a consideration of the dynamics of deuterium distribution. The Journal of Clinical Investigation. 29 (10), 1296-1310 (1950).

Tags

Keywords: Fatty Acid SynthesisDeuterium OxideNon-invasiveIsotope-labeled GlucoseMetabolic StatusChloroform-methanol ExtractionFatty Acid MethylationGC-MS Analysis
check_url/64219?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Turner, R., Mukherjee, R., Wallace, M., Sanchez-Gurmaches, J. Quantitative Determination of De Novo Fatty Acid Synthesis in Brown Adipose Tissue Using Deuterium Oxide. J. Vis. Exp. (195), e64219, doi:10.3791/64219 (2023).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image