Nous présentons ici une méthode quantitative peu coûteuse utilisant l’oxyde de deutérium et la chromatographie en phase gazeuse par spectrométrie de masse (GCMS) pour l’analyse de la lipogenèse de novo des acides gras totaux dans le tissu adipeux brun in vivo.
La synthèse des acides gras est une voie métabolique complexe et très énergivore qui joue un rôle fonctionnel important dans le contrôle de l’homéostasie métabolique du corps entier et d’autres processus physiologiques et pathologiques. Contrairement à d’autres voies métaboliques clés, telles que l’élimination du glucose, la synthèse des acides gras n’est pas systématiquement évaluée fonctionnellement, ce qui conduit à des interprétations incomplètes de l’état métabolique. De plus, il n’existe pas de protocoles détaillés accessibles au public et adaptés aux nouveaux arrivants dans le domaine. Nous décrivons ici une méthode quantitative peu coûteuse utilisant l’oxyde de deutérium et la chromatographie en phase gazeuse par spectrométrie de masse (GCMS) pour l’analyse de la synthèse de novo d’acides gras totaux dans le tissu adipeux brun in vivo. Cette méthode mesure la synthèse des produits de la synthase d’acide gras indépendamment d’une source de carbone, et elle est potentiellement utile pour pratiquement tous les tissus, dans n’importe quel modèle de souris, et sous n’importe quelle perturbation externe. Des détails sur la préparation de l’échantillon pour le SMGC et les calculs en aval sont fournis. Nous nous concentrons sur l’analyse de la graisse brune en raison de ses niveaux élevés de synthèse d’acides gras de novo et de son rôle essentiel dans le maintien de l’homéostasie métabolique.
L’obésité et les maladies métaboliques associées sont une pandémie qui met en danger les générations actuelles et futures 1,2. Communément simplifié comme la conséquence du déséquilibre entre l’apport et la dépense énergétique, le dérèglement métabolique associé à l’obésité affecte un grand nombre de voies métaboliques contrôlées par des facteurs environnementaux etendogènes3. Cependant, seules quelques voies sont systématiquement testées dans des modèles animaux de dérégulation métabolique.
À titre d’exemple, l’élimination du glucose est régulièrement mesurée par des tests de tolérance au glucose et à l’insuline, probablement en raison de la simplicité d’utilisation des glucomètres portables4. Les taux relatifs d’oxydation du glucose et des lipides dans l’ensemble du corps sont également estimés de manière routinière sur la base du rapport d’échange respiratoire à partir d’essais calorimétriques indirects 5,6. Cependant, la majorité de tous les autres aspects du métabolisme ne sont pas systématiquement évalués fonctionnellement. Cela conduit à des interprétations incomplètes de l’état métabolique et à des options thérapeutiques manquées. L’une de ces principales voies est la lipogenèse de novo.
La lipogenèse de novo (DNL) est le processus par lequel de nouveaux acides gras sont générés à partir de précurseurs. Le glucose est considéré comme le principal précurseur contribuant à la DNL7 du corps entier, mais d’autres précurseurs, tels que l’acétate, le fructose, le lactate et les acides aminés à chaîne ramifiée, se sont avérés être des sources de carbone pertinentes d’une manière dépendante de l’espace et de l’état 8,9,10,11,12. Le DNL est un contributeur clé à l’homéostasie métabolique et est essentiel au développement normal13. De plus, des altérations de la DNL ont été associées au cancer 14,15 et métabolique 16,17,18 et aux maladies cardiovasculaires 19,20.
La voie DNL est composée des composants enzymatiques de base ATP citrate lyase (ACLY), acétyl-CoA carboxylase (ACC1/2) et acide gras synthase (FAS) qui produisent principalement du palmitate, un acide gras saturé à 16 carbones. Cependant, les acides gras à chaîne impaire et à chaîne ramifiée peuvent également être produits à des taux plus faibles9. Les élongases et les désaturases modifient davantage ces acides gras, créant une gamme diversifiée d’espèces d’acides gras utiles à diverses fonctions (par exemple, le stockage d’énergie à long terme et la manipulation de la fluidité membranaire).
L’expression de la machinerie enzymatique DNL est contrôlée par un petit nombre de facteurs de transcription. Les plus bien décrites à ce jour comprennent la famille des protéines de liaison aux éléments régulateurs des stérols (SREBP), la protéine de liaison aux éléments de réponse glucidique (ChREBP) et le récepteur X du foie (LXR)21,22,23,24,25,26. Malgré un chevauchement apparent de leurs fonctions, des régulations individuelles basées sur la dominance du type cellulaire et les conditions physiologiques ou pathologiques ont été rapportées21,22,27,28.
Fait remarquable, un certain nombre d’inhibiteurs de certaines étapes de la voie DNL ont été approuvés pour une utilisation clinique ou sont à des stades précliniques ou cliniques de développement pour un certain nombre de maladies, notamment l’obésité, la stéatose hépatique non alcoolique/stéatohépatite non alcoolique (NAFLD/NASH) et les maladies cardiovasculaires29. Ces efforts mettent en évidence la pertinence de la DNL dans le domaine de la santé et de la maladie.
Au cours des dernières années, l’utilisation de méthodes d’évaluation quantitative de la synthèse des acides gras de novo a augmenté30. La méthode la plus courante pour évaluer cela est l’utilisation d’eau lourde marquée (D2O), où l’hydrogène lourd marqué est incorporé dans des chaînes acyle lors de la synthèse à la fois directement et indirectement, via l’échange de deutérium avec les hydrogènes des substrats DNL NAPDH, acétyl-CoA et malonyl-CoA. Bien que cette approche gagne en popularité, il y a un manque de protocoles détaillés accessibles au public et adaptés aux nouveaux arrivants dans le domaine. Nous décrivons ici une méthode d’évaluation quantitative de la synthèse de novo des produits du SAF à l’aide du D2O et de la chromatographie en phase gazeuse par spectrométrie de masse (GCMS), avec des calculs précédemment développés par Lee et al.31. Cette méthode mesure la synthèse d’acides gras de novo indépendamment d’une source de carbone, et elle est potentiellement utile pour pratiquement tous les tissus, dans n’importe quel modèle murin et sous n’importe quelle perturbation externe. Ici, nous nous concentrons sur l’analyse du tissu adipeux brun (BAT) en raison de ses niveaux élevés de DNL et de son rôle essentiel dans le maintien de l’homéostasie métabolique.
Comprendre l’équilibre et l’interaction entre des voies métaboliques complexes est une étape indispensable pour comprendre les bases biologiques des maladies métaboliques. Ici, nous montrons une méthodologie non invasive et peu coûteuse pour déterminer les changements dans la synthèse des acides gras de novo. Cette méthode est adaptée de méthodes publiées antérieurement qui ont mis au point des calculs pour estimer le flux de synthèse de novo à partir de l’enrichissement en deutéri…
The authors have nothing to disclose.
Nous remercions les membres du laboratoire Sanchez-Gurmaches et Wallace pour leurs précieuses discussions. Ce travail a été soutenu par des subventions de l’American Heart Association (18CDA34080527 à JSG et 19POST34380545 à RM), du NIH (R21OD031907 à JSG), d’un prix du CCHMC Trustee, d’un prix du Centre de génomique pédiatrique du CCHMC et d’un prix du Centre de génomique et de thérapeutique mendélienne du CCHMC. Ce travail a été soutenu en partie par le NIH P30 DK078392 du Centre central de recherche sur les maladies digestives à Cincinnati. Le contenu relève de la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les opinions officielles des National Institutes of Health. RT et MW ont été soutenus par une bourse Ad Astra de l’UCD.
4 mL Glass Vials | Fisher Scientific | 14-955-334 | |
0.2 µm filter | Olympus Plastic | 25-244 | |
26G needeled syringes | BD | 309597 | |
Acetone | Merck | 34850 | |
Acetonitrile | Merck | 900667 | |
Blue GC screw cap with septa | Agilent | 5190-1599 | |
Centrifuge | Eppendorf | 5424R | |
Chloroform | Sigma | 366927 | |
Deuterium oxide | Sigma | 151882 | |
Di-tert-butyl-4-methylphenol (BHT) Select FAME Column |
Merck | B1378 | |
Di-tert-butyl-4-methylphenol (BHT) Select FAME Column |
Agilent | CP7419 | |
EDTA tube | Sarstedt | 411395105 | |
Ethanol | Merck | 51976 | |
Hexadecenoic-d31 Acid | Larodan | 71-1631 | |
Hexane | Merck | 34859 | |
Methanol | Merck | 34860 | |
Microcentrifuge tube | Olympus Plastic | 24-282 | |
Mouse environmental chamber | Caron | Caron 7001-33 | |
Potasium Chloride | Fisher Bioreagents | BP366-500 | |
Potasium Phosphate | MP Biomedicals | 194727 | |
SafeLock microcentrifuge tubes | Eppendorf | 30120086 | |
Screw top amber GC vial | Agilent | 5182-0716 | |
Sodium Chloride | Fisher Bioreagents | BP358-212 | |
Sodium Hydroxide | Merck | S5881 | |
Sodium Phosphate, dibasic | Fisher Bioreagents | BP332-500 | |
Sodium Sulfate | Merck | 239313 | |
Sulfuric Acid | Merck | 258105 | |
Vial insert | Agilent | 5183-2088 |