Détermination quantitative de la synthèse d’acides gras de novo dans le tissu adipeux brun à l’aide d’oxyde de deutérium

Summary

Nous présentons ici une méthode quantitative peu coûteuse utilisant l’oxyde de deutérium et la chromatographie en phase gazeuse par spectrométrie de masse (GCMS) pour l’analyse de la lipogenèse de novo des acides gras totaux dans le tissu adipeux brun in vivo.

Abstract

La synthèse des acides gras est une voie métabolique complexe et très énergivore qui joue un rôle fonctionnel important dans le contrôle de l’homéostasie métabolique du corps entier et d’autres processus physiologiques et pathologiques. Contrairement à d’autres voies métaboliques clés, telles que l’élimination du glucose, la synthèse des acides gras n’est pas systématiquement évaluée fonctionnellement, ce qui conduit à des interprétations incomplètes de l’état métabolique. De plus, il n’existe pas de protocoles détaillés accessibles au public et adaptés aux nouveaux arrivants dans le domaine. Nous décrivons ici une méthode quantitative peu coûteuse utilisant l’oxyde de deutérium et la chromatographie en phase gazeuse par spectrométrie de masse (GCMS) pour l’analyse de la synthèse de novo d’acides gras totaux dans le tissu adipeux brun in vivo. Cette méthode mesure la synthèse des produits de la synthase d’acide gras indépendamment d’une source de carbone, et elle est potentiellement utile pour pratiquement tous les tissus, dans n’importe quel modèle de souris, et sous n’importe quelle perturbation externe. Des détails sur la préparation de l’échantillon pour le SMGC et les calculs en aval sont fournis. Nous nous concentrons sur l’analyse de la graisse brune en raison de ses niveaux élevés de synthèse d’acides gras de novo et de son rôle essentiel dans le maintien de l’homéostasie métabolique.

Introduction

L’obésité et les maladies métaboliques associées sont une pandémie qui met en danger les générations actuelles et futures ^1,2. Communément simplifié comme la conséquence du déséquilibre entre l’apport et la dépense énergétique, le dérèglement métabolique associé à l’obésité affecte un grand nombre de voies métaboliques contrôlées par des facteurs environnementaux et^endogènes3. Cependant, seules quelques voies sont systématiquement testées dans des modèles animaux de dérégulation métabolique.

À titre d’exemple, l’élimination du glucose est régulièrement mesurée par des tests de tolérance au glucose et à l’insuline, probablement en raison de la simplicité d’utilisation des glucomètres portables⁴. Les taux relatifs d’oxydation du glucose et des lipides dans l’ensemble du corps sont également estimés de manière routinière sur la base du rapport d’échange respiratoire à partir d’essais calorimétriques indirects ^5,6. Cependant, la majorité de tous les autres aspects du métabolisme ne sont pas systématiquement évalués fonctionnellement. Cela conduit à des interprétations incomplètes de l’état métabolique et à des options thérapeutiques manquées. L’une de ces principales voies est la lipogenèse de novo.

La lipogenèse de novo (DNL) est le processus par lequel de nouveaux acides gras sont générés à partir de précurseurs. Le glucose est considéré comme le principal précurseur contribuant à la DNL⁷ du corps entier, mais d’autres précurseurs, tels que l’acétate, le fructose, le lactate et les acides aminés à chaîne ramifiée, se sont avérés être des sources de carbone pertinentes d’une manière dépendante de l’espace et de l’état 8,9,10,11,12. Le DNL est un contributeur clé à l’homéostasie métabolique et est essentiel au développement normal¹³. De plus, des altérations de la DNL ont été associées au cancer 14,15 et métabolique 16,17,18 et aux maladies cardiovasculaires ^19,20.

La voie DNL est composée des composants enzymatiques de base ATP citrate lyase (ACLY), acétyl-CoA carboxylase (ACC1/2) et acide gras synthase (FAS) qui produisent principalement du palmitate, un acide gras saturé à 16 carbones. Cependant, les acides gras à chaîne impaire et à chaîne ramifiée peuvent également être produits à des taux plus faibles⁹. Les élongases et les désaturases modifient davantage ces acides gras, créant une gamme diversifiée d’espèces d’acides gras utiles à diverses fonctions (par exemple, le stockage d’énergie à long terme et la manipulation de la fluidité membranaire).

L’expression de la machinerie enzymatique DNL est contrôlée par un petit nombre de facteurs de transcription. Les plus bien décrites à ce jour comprennent la famille des protéines de liaison aux éléments régulateurs des stérols (SREBP), la protéine de liaison aux éléments de réponse glucidique (ChREBP) et le récepteur X du foie (LXR)21,22,23,24,25,26. Malgré un chevauchement apparent de leurs fonctions, des régulations individuelles basées sur la dominance du type cellulaire et les conditions physiologiques ou pathologiques ont été rapportées^21,22,27,28.

Fait remarquable, un certain nombre d’inhibiteurs de certaines étapes de la voie DNL ont été approuvés pour une utilisation clinique ou sont à des stades précliniques ou cliniques de développement pour un certain nombre de maladies, notamment l’obésité, la stéatose hépatique non alcoolique/stéatohépatite non alcoolique (NAFLD/NASH) et les maladies cardiovasculaires²⁹. Ces efforts mettent en évidence la pertinence de la DNL dans le domaine de la santé et de la maladie.

Au cours des dernières années, l’utilisation de méthodes d’évaluation quantitative de la synthèse des acides gras de novo a augmenté³⁰. La méthode la plus courante pour évaluer cela est l’utilisation d’eau lourde marquée (D₂O), où l’hydrogène lourd marqué est incorporé dans des chaînes acyle lors de la synthèse à la fois directement et indirectement, via l’échange de deutérium avec les hydrogènes des substrats DNL NAPDH, acétyl-CoA et malonyl-CoA. Bien que cette approche gagne en popularité, il y a un manque de protocoles détaillés accessibles au public et adaptés aux nouveaux arrivants dans le domaine. Nous décrivons ici une méthode d’évaluation quantitative de la synthèse de novo des produits du SAF à l’aide du D₂O et de la chromatographie en phase gazeuse par spectrométrie de masse (GCMS), avec des calculs précédemment développés par Lee et ^al.31. Cette méthode mesure la synthèse d’acides gras de novo indépendamment d’une source de carbone, et elle est potentiellement utile pour pratiquement tous les tissus, dans n’importe quel modèle murin et sous n’importe quelle perturbation externe. Ici, nous nous concentrons sur l’analyse du tissu adipeux brun (BAT) en raison de ses niveaux élevés de DNL et de son rôle essentiel dans le maintien de l’homéostasie métabolique.

Protocol

Toutes les expériences ont été approuvées par le comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux du centre médical de l’hôpital pour enfants de Cincinnati. 1. Préparation du D2O REMARQUE : Pour éviter les variations expérimentales, préparez suffisamment de solution / d’eau potable pour toutes les souris pendant toute la durée de l’expérience. Pour l’injection intrapéritonéale : générer 0,9…

Representative Results

Sur la base de la dose de D 2 O décrite à l’étape 1, nous constatons généralement que l’eau corporelle est enrichie de l’ordre de2,5% à 6 % et qu’un niveau de base d’enrichissement en deutérium dans l’eau corporelle est rapidement atteint en 1 h et maintenu pendant toute la durée de l’étude via de l’eau potable enrichie à 8 % (Figure 1). L’enrichissement continu en eau corporelle à l’état d’équilibre est une hypothèse des calculs utilis…

Discussion

Comprendre l’équilibre et l’interaction entre des voies métaboliques complexes est une étape indispensable pour comprendre les bases biologiques des maladies métaboliques. Ici, nous montrons une méthodologie non invasive et peu coûteuse pour déterminer les changements dans la synthèse des acides gras de novo. Cette méthode est adaptée de méthodes publiées antérieurement qui ont mis au point des calculs pour estimer le flux de synthèse de novo à partir de l’enrichissement en deutéri…

Materials

4 mL Glass Vials	Fisher Scientific	14-955-334
0.2 µm filter	Olympus Plastic	25-244
26G needeled syringes	BD	309597
Acetone	Merck	34850
Acetonitrile	Merck	900667
Blue GC screw cap with septa	Agilent	5190-1599
Centrifuge	Eppendorf	5424R
Chloroform	Sigma	366927
Deuterium oxide	Sigma	151882
Di-tert-butyl-4-methylphenol (BHT) Select FAME Column	Merck	B1378
Di-tert-butyl-4-methylphenol (BHT) Select FAME Column	Agilent	CP7419
EDTA tube	Sarstedt	411395105
Ethanol	Merck	51976
Hexadecenoic-d31 Acid	Larodan	71-1631
Hexane	Merck	34859
Methanol	Merck	34860
Microcentrifuge tube	Olympus Plastic	24-282
Mouse environmental chamber	Caron	Caron 7001-33
Potasium Chloride	Fisher Bioreagents	BP366-500
Potasium Phosphate	MP Biomedicals	194727
SafeLock microcentrifuge tubes	Eppendorf	30120086
Screw top amber GC vial	Agilent	5182-0716
Sodium Chloride	Fisher Bioreagents	BP358-212
Sodium Hydroxide	Merck	S5881
Sodium Phosphate, dibasic	Fisher Bioreagents	BP332-500
Sodium Sulfate	Merck	239313
Sulfuric Acid	Merck	258105
Vial insert	Agilent	5183-2088