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Biology

Quantitative Bestimmung der de novo Fettsäuresynthese im braunen Fettgewebe mittels Deuteriumoxid

Published: May 12, 2023
doi:
10.3791/64219
, , ,
1UCD Conway Institute and UCD Institute of Food and Health, School of Agriculture and Food Science,University College Dublin, 2Division of Endocrinology,Cincinnati Children’s Hospital Medical Center, Cincinnati, 3Division of Developmental Biology,Cincinnati Children’s Hospital Medical Center, Cincinnati, 4Department of Pediatrics,University of Cincinnati College of Medicine

Summary

In dieser Arbeit stellen wir eine kostengünstige quantitative Methode vor, die Deuteriumoxid- und Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GCMS) zur Analyse der Gesamtfettsäure-De-novo-Lipogenese in braunem Fettgewebe in vivo verwendet.

Abstract

Die Fettsäuresynthese ist ein komplexer und sehr energieintensiver Stoffwechselweg mit wichtigen funktionellen Rollen bei der Steuerung der metabolischen Homöostase des gesamten Körpers und anderer physiologischer und pathologischer Prozesse. Im Gegensatz zu anderen wichtigen Stoffwechselwegen, wie z. B. der Glukoseentsorgung, wird die Fettsäuresynthese nicht routinemäßig funktionell bewertet, was zu unvollständigen Interpretationen des Stoffwechselstatus führt. Darüber hinaus fehlt es an öffentlich zugänglichen detaillierten Protokollen, die für Neulinge auf diesem Gebiet geeignet sind. In dieser Arbeit beschreiben wir eine kostengünstige quantitative Methode, die Deuteriumoxid- und Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GCMS) zur Analyse der Gesamtfettsäuresynthese in braunem Fettgewebe in vivo verwendet. Diese Methode misst die Synthese der Produkte der Fettsäuresynthase unabhängig von einer Kohlenstoffquelle und ist potenziell für praktisch jedes Gewebe, in jedem Mausmodell und unter jeder externen Störung nützlich. Details zur Probenvorbereitung für GCMS und nachgelagerte Berechnungen werden bereitgestellt. Wir konzentrieren uns auf die Analyse von braunem Fett aufgrund seiner hohen De-novo-Fettsäuresynthese und seiner kritischen Rolle bei der Aufrechterhaltung der metabolischen Homöostase.

Introduction

Adipositas und damit verbundene Stoffwechselerkrankungen sind eine Pandemie, die gegenwärtige und zukünftige Generationen gefährdet 1,2. Die mit Fettleibigkeit verbundene metabolische Dysregulation, die gemeinhin als Folge des Ungleichgewichts zwischen Energieaufnahme und -verbrauch vereinfacht wird, betrifft eine große Anzahl von Stoffwechselwegen, die durch Umwelt- und endogene Faktoren gesteuert werden3. Allerdings werden nur wenige Signalwege routinemäßig in Tiermodellen der metabolischen Dysregulation getestet.

Beispielsweise wird die Glukoseentsorgung routinemäßig durch Glukose- und Insulintoleranztests gemessen, was wahrscheinlich auf die Einfachheit der Verwendung tragbarer Glukosemessgeräte zurückzuführenist 4. Die relativen Raten der Ganzkörperglukose und der Lipidoxidation werden ebenfalls routinemäßig auf der Grundlage des respiratorischen Austauschverhältnisses aus indirekten Kalorimetrie-Assays geschätzt 5,6. Die meisten anderen Aspekte des Stoffwechsels werden jedoch nicht routinemäßig funktionell erfasst. Dies führt zu unvollständigen Interpretationen des Stoffwechselstatus und verpassten Therapieoptionen. Einer der wichtigsten dieser Wege ist die de novo Lipogenese.

Die De-novo-Lipogenese (DNL) ist der Prozess, bei dem aus Vorläufern neue Fettsäuren gebildet werden. Glukose wird als der Hauptvorläufer angesehen, der zum Ganzkörper-DNL7 beiträgt, jedoch haben sich andere Vorläufer wie Acetat, Fruktose, Laktat und verzweigtkettige Aminosäuren als relevante Kohlenstoffquellen in räumlicher und zustandsabhängiger Weise erwiesen 8,9,10,11,12. DNL leistet einen wichtigen Beitrag zur metabolischen Homöostase und ist für die normale Entwicklung unerlässlich13. Darüber hinaus wurden Veränderungen des DNL mit Krebs 14,15 und metabolischen 16,17,18 und Herz-Kreislauf-Erkrankungen 19,20 in Verbindung gebracht.

Der DNL-Signalweg besteht aus den enzymatischen Kernkomponenten ATP-Citrat-Lyase (ACLY), Acetyl-CoA-Carboxylase (ACC1/2) und Fettsäuresynthase (FAS), die hauptsächlich Palmitat, eine gesättigte Fettsäure mit 16 Kohlenstoffatomen, produzieren. Ungerade und verzweigtkettige Fettsäuren können jedoch auch mit geringeren Raten produziert werden9. Elongasen und Desaturasen modifizieren diese Fettsäuren weiter, wodurch eine Vielzahl von Fettsäurespezies entsteht, die für eine Vielzahl von Funktionen nützlich sind (z. B. langfristige Energiespeicherung und Manipulation der Membranfluidität).

Die Expression der DNL-Enzymmaschinerie wird durch eine kurze Anzahl von Transkriptionsfaktoren gesteuert. Zu den bisher am besten beschriebenen gehören die Familie der sterolregulatorischen Elementbindungsproteine (SREBP), des Kohlenhydratreaktionselement-bindenden Proteins (ChREBP) und des Leber-X-Rezeptors (LXR)21,22,23,24,25,26. Trotz einer offensichtlichen Überlappung ihrer Funktionen wurden individuelle Regulationen beschrieben, die auf der Dominanz des Zelltyps und physiologischen oder pathologischen Bedingungen basieren21,22,27,28.

Bemerkenswert ist, dass eine Reihe von Inhibitoren für ausgewählte Schritte des DNL-Signalwegs für eine Reihe von Krankheiten, darunter Fettleibigkeit, nichtalkoholische Fettlebererkrankung/nichtalkoholische Steatohepatitis (NAFLD/NASH) und Herz-Kreislauf-Erkrankungen, für den klinischen Einsatz zugelassen wurden oder sich in der präklinischen oder klinischen Entwicklungsphase befinden29. Diese Bemühungen unterstreichen die Bedeutung von DNL für Gesundheit und Krankheit.

In den letzten Jahren hat der Einsatz von Methoden zur quantitativen Bewertung der De-novo-Fettsäuresynthese zugenommen30. Die gebräuchlichste Methode zur Beurteilung ist die Verwendung von schwer markiertem Wasser (D2O), bei dem der schwer markierte Wasserstoff während der Synthese sowohl direkt als auch indirekt über den Deuteriumaustausch mit den Wasserstoffen der DNL-Substrate NAPDH, Acetyl-CoA und Malonyl-CoA in Acylketten eingebaut wird. Obwohl dieser Ansatz immer beliebter wird, fehlt es an öffentlich zugänglichen detaillierten Protokollen, die für Neulinge auf diesem Gebiet geeignet sind. Hier skizzieren wir eine Methode zur quantitativen Bewertung der de novo Synthese von FAS-Produkten mittelsD2Ound Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GCMS), mit Berechnungen, die zuvor von Lee et al.31 entwickelt wurden. Diese Methode misst die De-novo-Fettsäuresynthese unabhängig von einer Kohlenstoffquelle und ist potenziell für praktisch jedes Gewebe, in jedem Mausmodell und unter jeder externen Störung nützlich. Hier konzentrieren wir uns auf die Analyse von braunem Fettgewebe (BAT) aufgrund seines hohen DNL-Gehalts und seiner entscheidenden Rolle bei der Aufrechterhaltung der metabolischen Homöostase.

Protocol

Alle Versuche wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee des Cincinnati Children’s Hospital Medical Center genehmigt. 1. Herstellung von D2O HINWEIS: Um experimentelle Abweichungen zu vermeiden, bereiten Sie für die Dauer des Versuchs ausreichend Lösung/Trinkwasser für alle Mäuse vor. Für die intraperitoneale Injektion: Erzeugen Sie 0,9 Gew.-% KochsalzlösungD2Odurch Auflösen von 9 g NaCl pro Liter<s…

Representative Results

Basierend auf der in Schritt 1 beschriebenenD2O-Dosierungstellen wir typischerweise fest, dass das Körperwasser im Bereich von 2,5 % bis 6 % angereichert ist und dass ein Ausgangsniveau der Deuteriumanreicherung im Körperwasser schnell in 1 h erreicht und für die Dauer der Studie über 8 % angereichertes Trinkwasser aufrechterhalten wird (Abbildung 1). Die kontinuierliche stationäre Körperwasseranreicherung ist eine Annahme der in Schritt 6 verwendeten Berechnungen, …

Discussion

Das Verständnis des Gleichgewichts und der Wechselwirkung zwischen komplexen Stoffwechselwegen ist ein unverzichtbarer Schritt, um die biologischen Grundlagen von Stoffwechselerkrankungen zu verstehen. Hier zeigen wir eine nicht-invasive und kostengünstige Methodik, um Veränderungen in der de novo Fettsäuresynthese zu bestimmen. Diese Methode ist von früher veröffentlichten Methoden adaptiert, die Berechnungen zur Schätzung des De-novo-Syntheseflusses aus der Fettsäure-Deuterium-Anreicherung<sup…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken den Sanchez-Gurmaches und den Mitgliedern des Wallace-Labors für wertvolle Gespräche. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der American Heart Association (18CDA34080527 an JSG und 19POST34380545 an RM), der NIH (R21OD031907 an JSG), einen CCHMC Trustee Award, einen CCHMC Center for Pediatric Genomics Award und einen CCHMC Center for Mendelian Genomics & Therapeutics Award unterstützt. Diese Arbeit wurde teilweise von NIH P30 DK078392 des Digestive Diseases Research Core Center in Cincinnati unterstützt. Der Inhalt liegt in der alleinigen Verantwortung der Autoren und stellt nicht unbedingt die offizielle Meinung der National Institutes of Health dar. RT und MW wurden durch ein UCD Ad Astra Fellowship unterstützt.

Materials

4 mL Glass Vials Fisher Scientific 14-955-334
0.2 µm filter Olympus Plastic 25-244
26G needeled syringes BD 309597
Acetone Merck 34850
Acetonitrile Merck 900667
Blue GC screw cap with septa Agilent 5190-1599
Centrifuge Eppendorf 5424R
Chloroform Sigma 366927
Deuterium oxide Sigma 151882
Di-tert-butyl-4-methylphenol (BHT)
Select FAME Column		 Merck B1378
Di-tert-butyl-4-methylphenol (BHT)
Select FAME Column		 Agilent CP7419
EDTA tube Sarstedt 411395105
Ethanol Merck 51976
Hexadecenoic-d31 Acid Larodan 71-1631
Hexane Merck 34859
Methanol Merck 34860
Microcentrifuge tube Olympus Plastic 24-282
Mouse environmental chamber Caron Caron 7001-33
Potasium Chloride Fisher Bioreagents BP366-500
Potasium Phosphate MP Biomedicals 194727
SafeLock microcentrifuge tubes Eppendorf 30120086
Screw top amber GC vial Agilent 5182-0716
Sodium Chloride Fisher Bioreagents BP358-212
Sodium Hydroxide Merck S5881
Sodium Phosphate, dibasic Fisher Bioreagents BP332-500
Sodium Sulfate Merck 239313
Sulfuric Acid Merck 258105
Vial insert Agilent 5183-2088
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Turner, R., Mukherjee, R., Wallace, M., Sanchez-Gurmaches, J. Quantitative Determination of De Novo Fatty Acid Synthesis in Brown Adipose Tissue Using Deuterium Oxide. J. Vis. Exp. (195), e64219, doi:10.3791/64219 (2023).
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