Burada, in vivo kahverengi yağ dokusunda toplam yağ asidi de novo lipogenezinin analizi için döteryum oksit ve gaz kromatografisi kütle spektrometrisi (GCMS) kullanan ucuz bir kantitatif yöntem sunuyoruz.
Yağ asidi sentezi, tüm vücut metabolik homeostazının ve diğer fizyolojik ve patolojik süreçlerin kontrolünde önemli fonksiyonel rollere sahip karmaşık ve yüksek enerji gerektiren bir metabolik yoldur. Glikoz imhası gibi diğer önemli metabolik yolların aksine, yağ asidi sentezi rutin olarak işlevsel olarak değerlendirilmez ve bu da metabolik durumun eksik yorumlanmasına yol açar. Buna ek olarak, bu alanda yeni gelenler için uygun, kamuya açık ayrıntılı protokollerin eksikliği vardır. Burada, in vivo kahverengi yağ dokusunda toplam yağ asidi de novo sentezinin analizi için döteryum oksit ve gaz kromatografisi kütle spektrometrisi (GCMS) kullanan ucuz bir kantitatif yöntemi açıklıyoruz. Bu yöntem, bir karbon kaynağından bağımsız olarak yağ asidi sentaz ürünlerinin sentezini ölçer ve herhangi bir fare modelinde ve herhangi bir dış bozulma altında hemen hemen her doku için potansiyel olarak yararlıdır. GCMS için numune hazırlama ve sonraki hesaplamalar ile ilgili ayrıntılar verilmiştir. Yüksek seviyelerde de novo yağ asidi sentezi ve metabolik homeostazın korunmasındaki kritik rolleri nedeniyle kahverengi yağın analizine odaklanıyoruz.
Obezite ve buna bağlı metabolik hastalıklar, şimdiki ve gelecek nesilleri tehlikeye atan bir salgındır 1,2. Enerji alımı ve harcaması arasındaki dengesizliğin bir sonucu olarak yaygın olarak basitleştirilen obezite ile ilişkili metabolik düzensizlik, çevresel ve endojen faktörler tarafından kontrol edilen çok sayıda metabolik yolu etkiler3. Bununla birlikte, metabolik düzensizliğin hayvan modellerinde sadece birkaç yol rutin olarak test edilir.
Örnek olarak, glikoz imhası, muhtemelen taşınabilir glikoz monitörlerinin kullanımının basitliği nedeniyle, rutin olarak glikoz ve insülin tolerans testleri ile ölçülür4. Tüm vücut glukoz ve lipid oksidasyon nispi oranları da dolaylı kalorimetri testlerinden 5,6 elde edilen solunum değişim oranına dayalı olarak rutin olarak tahmin edilmektedir. Bununla birlikte, metabolizmanın diğer tüm yönlerinin çoğunluğu rutin olarak işlevsel olarak değerlendirilmez. Bu, metabolik durumun eksik yorumlanmasına ve terapötik seçeneklerin kaçırılmasına yol açar. Bu tür ana yollardan biri de novo lipogenezdir.
De novo lipogenez (DNL), öncüllerden yeni yağ asitlerinin üretildiği süreçtir. Glikoz, tüm vücut DNL7’ye katkıda bulunan ana öncü olarak kabul edilir, ancak asetat, fruktoz, laktat ve dallı zincirli amino asitler gibi diğer öncülerin, mekansal ve duruma bağlı bir şekilde ilgili karbon kaynakları olduğu gösterilmiştir 8,9,10,11,12. DNL, metabolik homeostaza önemli bir katkıda bulunur ve normal gelişim için gereklidir13. Ek olarak, DNL’deki değişiklikler kanser 14,15 ve metabolik 16,17,18 ve kardiyovasküler hastalıklar 19,20 ile ilişkilendirilmiştir.
DNL yolu, esas olarak 16 karbonlu doymuş bir yağ asidi olan palmitat üreten çekirdek enzimatik bileşenler ATP sitrat liyaz (ACLY), asetil-CoA karboksilaz (ACC1/2) ve yağ asidi sentazdan (FAS) oluşur. Bununla birlikte, tek zincirli ve dallı zincirli yağ asitleri de daha düşük oranlarda üretilebilir9. Uzamalar ve desatürazlar, bu yağ asitlerini daha da değiştirerek, çeşitli işlevler için yararlı olan çok çeşitli yağ asitleri türleri yaratır (örneğin, uzun süreli enerji depolama ve membran akışkanlığının manipülasyonu).
DNL enzimatik mekanizmasının ekspresyonu, kısa sayıda transkripsiyon faktörü tarafından kontrol edilir. Bugüne kadar en iyi tanımlananlar arasında sterol düzenleyici element bağlayıcı protein (SREBP) ailesi, karbonhidrat yanıt elemanı bağlayıcı protein (ChREBP) ve karaciğer X reseptörü (LXR)21,22,23,24,25,26 bulunur. İşlevlerinde belirgin bir örtüşmeye rağmen, hücre tipi baskınlığına ve fizyolojik veya patolojik koşullara dayalı bireysel düzenlemeler bildirilmiştir21,22,27,28.
Dikkat çekici bir şekilde, DNL yolunun seçilen adımları için bir dizi inhibitör klinik kullanım için onaylanmıştır veya obezite, alkolsüz yağlı karaciğer hastalığı / alkolsüz steatohepatit (NAFLD / NASH) ve kardiyovasküler hastalık dahil olmak üzere bir dizi hastalık için klinik öncesi veya klinik gelişim aşamalarındadır29. Bu çabalar, DNL’nin sağlık ve hastalıkla olan ilişkisini vurgulamaktadır.
Son yıllarda, de novo yağ asidi sentezini kantitatif olarak değerlendirmek için yöntemlerin kullanımı artmıştır30. Bunu değerlendirmek için en yaygın yöntem, ağır etiketli hidrojenin sentez sırasında hem doğrudan hem de dolaylı olarak, DNL substratları NAPDH, asetil-CoA ve malonil-CoA’nın hidrojenleri ile döteryum değişimi yoluyla asil zincirlerine dahil edildiği ağır etiketli suyun (D2O) kullanılmasıdır. Bu yaklaşım popülerlik kazanmasına rağmen, bu alanda yeni gelenler için uygun, kamuya açık ayrıntılı protokollerin eksikliği vardır. Burada, daha önce Lee ve ark.31 tarafından geliştirilen hesaplamalarla, D2Ove gaz kromatografisi kütle spektrometrisi (GCMS) kullanarak FAS ürünlerinin de novo sentezini nicel olarak değerlendirmek için bir yöntemin ana hatlarını çiziyoruz. Bu yöntem, bir karbon kaynağından bağımsız olarak de novo yağ asidi sentezini ölçer ve herhangi bir fare modelinde ve herhangi bir dış bozulma altında hemen hemen her doku için potansiyel olarak yararlıdır. Burada, yüksek DNL seviyeleri ve metabolik homeostazın korunmasındaki kritik rolleri nedeniyle kahverengi yağ dokusunun (BAT) analizine odaklanıyoruz.
Karmaşık metabolik yolaklar arasındaki dengeyi ve etkileşimi anlamak, metabolik ilişkili hastalıkların biyolojik temelini anlamak için vazgeçilmez bir adımdır. Burada, de novo yağ asidi sentezindeki değişiklikleri belirlemek için invaziv olmayan ve ucuz bir metodoloji gösteriyoruz. Bu yöntem, yağ asidi döteryum zenginleştirmesinden31 de novo sentez akısını tahmin etmek ve vücut suyundakiD2O’nunnispi yüzdesini belirlemek için döteryum-aseton d…
The authors have nothing to disclose.
Değerli tartışmalar için Sanchez-Gurmaches ve Wallace laboratuvar üyelerine teşekkür ederiz. Bu çalışma, Amerikan Kalp Derneği (18CDA34080527’den JSG’ye ve 19POST34380545’ten RM’ye), NIH (JSG’ye R21OD031907), CCHMC Mütevelli Ödülü, CCHMC Pediatrik Genomik Merkezi Ödülü ve CCHMC Mendel Genomik ve Terapötik Merkezi Ödülü’nden alınan hibelerle desteklenmiştir. Bu çalışma kısmen Cincinnati’deki Sindirim Hastalıkları Araştırma Çekirdek Merkezi’nin NIH P30 DK078392 tarafından desteklenmiştir. İçerik yalnızca yazarların sorumluluğundadır ve Ulusal Sağlık Enstitüleri’nin resmi görüşlerini temsil etmeyebilir. RT ve MW, UCD Ad Astra Bursu tarafından desteklendi.
4 mL Glass Vials | Fisher Scientific | 14-955-334 | |
0.2 µm filter | Olympus Plastic | 25-244 | |
26G needeled syringes | BD | 309597 | |
Acetone | Merck | 34850 | |
Acetonitrile | Merck | 900667 | |
Blue GC screw cap with septa | Agilent | 5190-1599 | |
Centrifuge | Eppendorf | 5424R | |
Chloroform | Sigma | 366927 | |
Deuterium oxide | Sigma | 151882 | |
Di-tert-butyl-4-methylphenol (BHT) Select FAME Column |
Merck | B1378 | |
Di-tert-butyl-4-methylphenol (BHT) Select FAME Column |
Agilent | CP7419 | |
EDTA tube | Sarstedt | 411395105 | |
Ethanol | Merck | 51976 | |
Hexadecenoic-d31 Acid | Larodan | 71-1631 | |
Hexane | Merck | 34859 | |
Methanol | Merck | 34860 | |
Microcentrifuge tube | Olympus Plastic | 24-282 | |
Mouse environmental chamber | Caron | Caron 7001-33 | |
Potasium Chloride | Fisher Bioreagents | BP366-500 | |
Potasium Phosphate | MP Biomedicals | 194727 | |
SafeLock microcentrifuge tubes | Eppendorf | 30120086 | |
Screw top amber GC vial | Agilent | 5182-0716 | |
Sodium Chloride | Fisher Bioreagents | BP358-212 | |
Sodium Hydroxide | Merck | S5881 | |
Sodium Phosphate, dibasic | Fisher Bioreagents | BP332-500 | |
Sodium Sulfate | Merck | 239313 | |
Sulfuric Acid | Merck | 258105 | |
Vial insert | Agilent | 5183-2088 |