Summary
여기에서는 X선 여기 발광 화학 이미징(XELCI)을 사용하여 이식된 의료 기기 주변의 화학 정보를 고분해능 광학 검출하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 새로운 이미징 기술은 임플란트 관련 감염 생화학을 연구할 수 있는 실험실에서 개발되었습니다.
Abstract
이식형 의료 기기와 관련된 미생물 감염은 골절 고정 실패의 주요 관심사입니다. 이러한 감염의 조기 진단은 두 번째 수술에 대한 추가 비용없이 항생제로 성공적으로 박멸 할 수 있습니다. 여기에서 XELCI는 높은 X선 해상도, 임플란트 특이성 및 이식된 의료 기기 표면 근처의 비침습적 이미지 화학 농도에 대한 화학적 민감성을 가진 기술로 설명합니다. 장치는 화학적으로 보고되는 표면으로 코팅되어 있습니다. 이 화학적으로 반응하는 표면은 이식 가능한 의료 기기에 코팅 된 두 개의 층으로 구성됩니다. 모니터링을 위해 적색 발광 섬광체(Gd2O2S:Eu) 층 위에 코팅되는 pH 민감성 층(브로모티몰 블루 또는 브로모크레졸 그린 혼입 하이드로겔)을 포함한다. 집속된 X선 빔이 임플란트의 한 지점을 조사하고 섬광체에서 생성된 적색광(620nm 및 700nm 피크 포함)이 감지층을 통과하여 pH에 따라 스펙트럼 비율이 변경됩니다. 임플란트를 가로질러 X선 빔을 스캔하고 조직을 통과하는 빛의 스펙트럼 비율을 점별로 측정하여 이미지를 생성합니다. 우리는 수정된 이식형 플레이트 센서로 이전에 대퇴골의 뼈 표면에서 임플란트 관련 감염을 모니터링하기 위해 이 이미징 기술을 사용했습니다. 이제 우리는 경골 골수내 막대 감염으로 인해 발생하는 pH 변화를 연구하고 있습니다. 파일럿 전 토끼 연구에는 두 가지 유형의 골수내 막대 디자인이 사용되었으며, XELCI 기술을 사용하여 뼈 표면뿐만 아니라 뼈 내부에서도 발생하는 화학적 변화를 모니터링할 수 있다는 것을 알게 되었습니다. 따라서 이를 통해 비침습적이고 높은 공간 분해능, 낮은 배경 국소 pH 이미징을 통해 임플란트 관련 감염 생화학을 연구할 수 있습니다.
Introduction
미국에서는 매년 약 200만 개의 골절 고정 장치가 삽입되며, 그 중 5%-10%가 임플란트 관련 감염을 유발한다1. 이러한 감염은 생물막의 이질성과 항생제 내성 특성으로 인해 후기 단계에서 항생제로 치료하기가 더 어렵습니다 2,3. 조기에 진단되면 항생제와 외과적 괴사조직 제거술로 감염을 치료하여 치료된 골절 부위의 하드웨어를 교체하기 위한 두 번째 수술에 대한 추가 의료 비용을 방지할 수 있습니다. 일반 방사선 촬영 및 기타 고급 방사선 촬영 기술은 정형외과 임플란트 관련 감염, 불유합 및 관련 합병증의 진단에 적용됩니다. 이러한 기술은 정형외과 임플란트에서 주변 뼈와 조직의 구조적 정보를 획득하는 데 자주 사용되지만 특정 환경에서 생화학적 정보를 제공할 수 없습니다. 따라서 우리는 임플란트 부위에서 비침습적으로 생화학 정보를 고해상도 이미징하기 위한 새로운 X선 여기 발광 화학 이미징(XELCI) 기술을 개발했습니다. 정형 외과 임플란트 관련 감염의 진단은 일반적으로 하나 또는 다른 수단의 조합에 의해 수행됩니다. 임상 관찰 (통증, 부기, 발적, 상처 분비물 등)은 감염의 첫 징후를 시사합니다. 나중에, 뼈 치유 진행의 실패를 확인하고 병원성 유기체 4,5를 확인하기 위해 방사선 및 실험실 실험이 수행된다. 컴퓨터 단층 촬영 (CT), 자기 공명 영상 (MRI)과 같은 핵 의약 기술 및 단일 광자 방출 컴퓨터 단층 촬영 (SPECT) 및 양전자 방출 단층 촬영 (PET)과 같은 방사성 뉴클레오티드 방법은 감염된 임플란트 및 관련 감염의 더 나은 시각화를 위해 사용됩니다 6,7. CT와 MRI는 각각 골 괴사와 연조직 이상을 판별하는 데 유리하지만, 금속 임플란트에 가까운 거리에서 간섭을 일으킨다8. 임플란트 관련 골수염을 진단하기 위해 생체 내 영상 조영제로서 방사성 동위원소 표지 분석물과 결합된 SPECT 및 PET와 같은 다양한 X선 방법론이 널리 활용되고 있다2. 현재 응용 분야는 CT 스캐닝 데이터와 SPECT 또는 PET의 라벨링 데이터를 결합하여 해부학적 정보를 생성합니다9. 이러한 이미징 양식 중 하나 이상이 감염 진단을 돕기 위해 사용되지만 추가 의료 및 수술 비용을 피하기 위해 항생제 치료를 시작하기 위해 감염과 관련된 pH 변화를 조기에 감지할 수 없습니다.
임플란트 관련 감염을 모니터링하기 위해 이 연구에 사용된 이미징 시스템을 활용하는 주요 이점은 스펙트럼 참조를 통해 생물막 미세 환경에 대한 생화학적 정보를 밝힐 수 있다는 것입니다. 주요 초점은 감염된 부위의 이미징 및 pH 매핑에 있지만 이 방법은 임플란트 관련 감염에 특이적인 다른 바이오마커를 모니터링하도록 변경할 수 있습니다. 따라서 XELCI를 통해 감염의 병태생리학을 이해할 수 있습니다. 높은 공간 해상도 이미징을 통해 감염이 증가함에 따라 이질성을 매핑할 수 있습니다. 생물막 형성이 일어나는 표면의 pH는 생화학적 변화를 이해하는 데 매우 중요합니다. 또한, 박테리아10,11에 의한 항생제 관련 스트레스 반응으로 인해 다른 미세 환경 변화가 발생할 수 있다. 표면 특이적 및 높은 공간 분해능 이미징으로 인해 생물막 미세 환경에 대한 항생제 효과를 모니터링할 수 있습니다. 이 기술은 표적 약물 전달 실험을 위한 생물막 환경을 연구하는 데에도 사용할 수 있습니다. 우리는 표적 낮은 pH 약물 방출 또는 pH를 높여 더 높은 pH에서 작용하기 쉽게 만들 수 있습니다.
이 이미징 기술의 세 가지 특정 특성은 X선 해상도, 임플란트 표면 특이성 및 화학적 민감도입니다(그림 1A). 이러한 특성은 정형외과 임플란트 관련 감염을 이미징하기 위해 현재 사용 가능한 이미징 기술과 비교할 수 있습니다(그림 1B). X선이 조사되면 임플란트 표면에 코팅된 형광체 입자는 조직의 몇 센티미터를 통과할 수 있는 적색 및 근적외선(NIR) 빛을 생성합니다(약간의 감쇠가 있긴 하지만)12,13. 표 1은 생물막 또는 조직을 통해 pH를 측정하는 데 사용된 다른 방법과 비교하여 개발된 이미징 시스템의 일부 기능을 보여줍니다.
XELCI는 그림 2와 같이 X선 여기와 결합하여 이식된 의료 기기 근처에서 광학적으로 높은 공간 분해능의 화학 정보를 획득하는 새로운 이미징 기술입니다. 여기서는 X선 여기성 형광체 입자의 선택적 여기 및 광학 검출이 활용됩니다. 임플란트는 신틸레이터 입자 층 위에 pH 민감성 염료가 포함된 폴리머 층인 두 개의 층으로 코팅됩니다. 일련의 집속 X선 빔이 임플란트를 조사하면 섬광체 층이 가시광선(620nm 및 700nm)을 생성합니다. 이렇게 생성된 빛은 pH 민감층을 통과하여 주변 환경의 pH에 따라 발광 스펙트럼을 조절합니다. 낮은 pH는 일반적으로 감염 및 생물막 형성과 관련이 있습니다. 감염이 진행됨에 따라 pH는 생리학적 pH(pH 7.2)에서 산성(pH 7 미만)으로 변하고 센서의 pH 염료는 색상과 흡광도를 변화시킵니다. 발광 스펙트럼의 변화는 pH 7 및 pH 4에서 브로모크레졸 녹색 pH 염료에 대한 그림 2E에 나와 있습니다. 조직과 뼈를 통해 투과된 빛이 수집되고 스펙트럼 비율이 pH를 결정합니다. pH 이미지를 생성하기 위해 집속된 X선 빔은 신틸레이터 필름에 한 번에 한 지점씩 조사하고 샘플 전체에 걸쳐 빔을 포인트별로 스캔합니다. 이전에는, 이 기술이 정형외과용 임플란트14,15의 표면의 이미지 pH 변화에 적용되었고, 뼈 및 조직을 통한 골수내 관내의 pH 변화를 모니터링하기 위해 이를 시험하였다.
아래 그림 3은 이미징 시스템의 개략도를 보여줍니다. 이미징 시스템의 기본 구성 요소는 폴리 모세관 광학 장치가 있는 X선 여기 소스, 두 개의 광전자 증배관에 연결되는 일체형 아크릴 광 가이드, X, Y 및 Z 전동 스테이지(30cm x 15cm x 6cm 이동) 및 데이터 수집을 위해 연결된 컴퓨터입니다. X선 소스, x, y, z 스테이지 및 수집 광학 장치(엘보우, 라이트 가이드, 광전자 증배관(PMT))는 X선 방지 인클로저에 있으며, X선 컨트롤러, PMT용 전원, 데이터 수집(DAQ) 보드 및 컴퓨터에 연결된 함수 발생기는 외부에 보관됩니다. 인클로저와 도어 전면 사이에 배치된 푸시 버튼(상시 개방 스위치)은 인터록 역할을 합니다. 도어가 완전히 닫히지 않은 경우(인터록 스위치가 열려 있는 경우) X선 소스가 켜지지 않고 작동 중에 열리면 X선 소스가 자동으로 꺼집니다. 모터는 연속 스캔을 실행할 수 있을 뿐만 아니라 개별 위치로 이동할 수 있습니다. y축의 스캔 속도는 일반적으로 1-5mm/s인 반면 x축의 스텝 크기는 일반적으로 150-2000μm에서 선택할 수 있습니다. 매개변수는 필요한 공간 분해능에 따라 선택할 수 있습니다. 연속 스캔을 통해 일정한 속도로 균일한 노출 시간을 확인할 수 있습니다.
집속된 X선 빔이 X선 발광 입자에 조사되면 생성된 빛은 주변 pH에 따라 빛을 변조하여 pH 감응막을 통과합니다. 투과된 빛은 조직과 상호 작용(부분적으로 산란 및 흡수)하는 반면, 산란 및 흡수에 의한 광 감쇠는 조직 두께가 증가함에 따라 증가합니다. 컬렉션 광학 장치에는 시작 부분에 반사 알루미늄 엘보우(90° 굽힘 및 광택 반사 내부 표면 포함)가 장착된 일체형 분기 아크릴 라이트 가이드가 포함됩니다. 이는 빛이 라이트 가이드에 도달하자마자 빛이 시준되도록 하기 위한 것입니다. 이러한 추가는 집광 효율을 크게 향상시켰습니다. 자세한 내용은 그림 4 에 엘보우와 라이트 가이드의 기계 도면이 나와 있습니다. 90° 엘보는 알루미늄으로 가공되었으며 내부 표면은 경면 마감 처리되었으며 라이트 가이드는 아크릴로 가공되었습니다. 또한 팔꿈치 시작 부분에 광범위한 장거리 통과 청색광 필터(350-450nm 빛 차단)를 부착하여 적색광만 통과하도록 했습니다. 일체형 아크릴 라이트 가이드의 끝은 두 개의 다른 PMT로 이어지는 두 개의 스트림으로 분기됩니다. PMT는 PMT를 ~5°C로 냉각하기 위해 열전 냉각기와 접촉하는 작은 기밀 금속 상자에 들어 있습니다. PMT 중 하나의 시작 부분에는 700nm 빛만 측정하기 위해 협범위 롱패스 필터(570-640nm 광 차단 및 640-740nm 광 통과)가 부착됩니다. 따라서 620nm 및 700nm 빛은 별도로 계산할 수 있습니다. PMT는 광자 계수 모드로 설정되며 검출된 각 광자에 대해 TTL(트랜지스터-트랜지스터 로직) 펄스를 생성합니다. DAQ 시스템은 USB 통신을 사용하여 펄스(포화점 2,000만 펄스/초)를 계산합니다. 데이터를 처리한 후 두 개의 개별 강도 맵이 생성되고 신호 파장 강도(620nm)와 기준 파장 강도(700nm)의 비율을 고려하여 최종 이미지가 생성됩니다. 이 비율은 전체 집광 효율의 차이를 설명하며, 이는 집광 광학 장치의 위치, X선 조사 강도 및 조직 두께에 따라 크게 달라집니다. 또한, pH 지시약 염료 없이 공간적으로 분리된 기준 영역은 파장 의존적 조직 침투로 인한 스펙트럼 왜곡을 설명합니다. 이미징 시스템을 제어하기 위해 그래픽 기반 프로그래밍 언어가 사용되며 작업의 기본 순서도가 아래에 나와 있습니다. 컴퓨터, X선 컨트롤러 및 DAQ 유닛을 제외한 이미징 설정은 방사선 노출을 최소화하기 위해 안전한 X선 인클로저에 포함되어 있습니다.
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Protocol
이 절차는 Clemson University Institutional Animal Care and Use Committee(IACUC)에서 승인한 동물 사용 프로토콜을 따릅니다. 실험은 클렘슨 대학교 생물 안전위원회 (IBC) 및 방사선 안전위원회 (RSC)에 따라 관련 지침 및 규정에 따라 수행됩니다.
참고: XELCI 스캔을 완료하기 위한 흐름도는 아래 그림 5 에 나와 있으며 이미징 절차에 대한 자세한 단계별 설명이 나와 있습니다.
1. 시스템 초기화 및 일반 방사선 사진 획득
- PMT 쿨러를 켜면 일반적으로 설정값(예: 15°C)에 도달하는 데 ~4분이 걸립니다. PMT를 켜기 전에 나머지 초기화 단계를 수행합니다.
- 이미징 시스템 제어 소프트웨어를 엽니다. 제어 소프트웨어 프로그램은 x-y-z 축 전동 스테이지를 통신하고 초기화합니다. 스테이지 x축과 y축을 원하는 시작 위치로 이동합니다.
- 샘플을 이동식 x-y-z 스테이지에 놓습니다. 샘플 높이(z축)를 배치하여 방사선 발광 장치가 X선 소스 및/또는 스테이지를 올리거나 내려 다모세관 초점 광학 장치보다 5-5.5cm 아래에 있도록 합니다. 또한 레이저 크로스헤드(X선 초점 모세관에 부착되고 X선이 초점을 맞출 위치와 교차하도록 서로 90°에 배치된 두 개의 빨간색 선 모양의 레이저 포인터)를 사용하여 xy 평면에 표본을 배치합니다. X선과 PMT를 켜기 전에 레이저를 끄십시오.
- 이미징 인클로저의 전면 도어에 푸시 버튼 인터록을 고정합니다. 광선 소스의 전원을 켭니다. 샘플의 일반 방사선 사진을 얻기 위해 초점 광학 장치를 제거합니다.
- X선 제어 소프트웨어를 열고 X선 전력을 설정합니다(전압 및 전류 조정). X선 제어 소프트웨어로 X선 셔터를 엽니다.
- 엑스레이 사진기를 위한 소프트웨어를 엽니다. 노출 버튼을 눌러 일반 방사선 사진을 찍습니다. 노출을 끄고 X-ray를 끕니다.
알림: 필요한 경우 s를 이동ample 위치를 개선하거나 다른 위치에서 일련의 X선을 획득하여 더 큰 방사선 사진을 얻기 위해 대조할 수 있습니다. 별도의 시스템에서 방사선 사진을 촬영할 수도 있지만, 검체가 움직이면 XELCI와 방사선 촬영의 공동 등록이 더 어려워집니다. - 인클로저 도어를 엽니다.
2. 선택적으로 X-ray를 끈 상태에서 백그라운드 스캔을 수행합니다
- 다모세관 광학 장치를 X선 소스에 다시 연결합니다.
- 인클로저를 닫고 인터록을 고정합니다. PMT 전원 공급 장치를 켭니다.
알림: PMT 전원 공급 장치는 빛에 과다 노출되지 않도록 문이 열리거나 열리려고 할 때마다 항상 꺼야 합니다. - 이미징 시스템 제어 소프트웨어를 열고 스텝 크기, 스캔 속도 및 스캔 영역을 지정합니다. 모든 매개변수가 설정되면 실행 버튼을 눌러 스캔을 시작합니다.
참고: 고해상도 스캔의 경우 스텝 크기는 1000μm이고 저해상도 스캔의 경우 스텝 크기는 250μm입니다. 스캔 속도는 5mm/s에서 1mm/s까지 선택할 수 있습니다. 스캔 영역은 샘플의 크기에 따라 다릅니다. - X-ray를 끈 상태에서 백그라운드 스캔을 실행하여 샘플 이외의 인클로저에 있는 모든 빛의 어두운 수를 확인합니다.
3. X-ray를 켠 상태에서 샘플 스캔 수행
- 샘플을 확인하십시오.amp스캔을 시작하기 위해 레이저 크로스 헤드로 여전히 올바른 위치에 있습니다.
- 인클로저를 닫고 인터록을 고정합니다. PMT가 꺼져 있는 경우(예: 문을 열기 전에 꺼진 경우) PMT 전원 공급 장치를 켭니다.
- 이미징 시스템 제어 소프트웨어를 엽니다. 단계 크기, 스캔 속도 및 스캔 영역에 대한 값을 입력합니다. 모든 매개변수가 설정되면 실행 버튼을 눌러 스캔을 시작합니다.
참고: 고해상도 스캔의 경우 스텝 크기는 1000μm이고 저해상도 스캔의 경우 스텝 크기는 250μm입니다. 스캔 속도는 5mm/s에서 1mm/s까지 선택할 수 있습니다. 스캔 영역은 샘플의 크기에 따라 다릅니다. - X-ray를 켠 상태에서 샘플에 대한 스캔을 얻습니다.
- 먼저 더 큰 스텝 크기와 더 빠른 스캔 속도로 저해상도 스캔을 수행하여 대상의 예비 이미지를 얻습니다. 샘플의 원하는 영역에 대한 저해상도 스캔을 얻은 후 더 작은 스텝 크기와 더 낮은 스캔 속도로 더 높은 해상도의 스캔을 얻습니다.
- 문을 열기 전에 PMT 전원 공급 장치를 끄십시오.
4. 이미지 형성
- 현재 스캔이 대상의 관심 영역을 이미징하고 있는지 확인합니다. 그렇지 않은 경우 중지 버튼을 눌러 현재 스캔을 중지 합니다.
- 제어 소프트웨어에서 스캔 위치를 다시 조정하고 실행 버튼을 다시 누르십시오.
참고: y축은 스캔의 첫 번째 행부터 계속 기록됩니다. 스캔을 수행하는 동안 각 파장당 카운트 수와 마지막으로 업데이트된 모터 위치 이후의 시간이 기록됩니다. 기록된 시간은 모터 속도의 변화, 즉 노출 시간을 고려합니다. 각 픽셀에 대해 counts/second가 정규화됩니다. y축 모터는 y축의 현재 행 끝을 스캔하기 위해 이동하고 모터는 시작 위치로 돌아갑니다. 그런 다음 x축 모터는 사용자가 정의한 스텝 크기만큼 위치를 늘리고 y축의 두 번째 행을 스캔합니다. 이 프로세스는 x축 모터가 x-방향에 대해 지정된 너비에 도달할 때까지 순환됩니다. 사용자는 스캔 크기, 모터 속도 및 모터 시작 위치를 제어할 수 있습니다. 단계 크기는 y축의 최종 이미지에서 픽셀의 크기를 결정합니다.
5. 무균 상태에서 이미징을 위한 박테리아 배양(박테리아 성장 센서가 이미징되는 경우)
- 황색포도상구균 1945(ATCC 25923)의 신선한 배양액을 준비하려면 1주일 이내에 줄무늬가 있는 TSA(트립틴 대두 한천) 플레이트에서 콜로니 하나를 사용하여 멸균 트립신 대두 브로스(TSB) 5mL를 접종합니다.
- 박테리아 배양액을 37°C에서 16-18시간 동안 정지 상태가 될 때까지 부드럽게 흔든다.
- 다음으로, 실온(RT)에서 10분 동안 4000 x g 에서 원심분리를 통해 TSB로부터 배양된 펠렛을 펠렛화하고, 펠렛을 인산염 완충용액(PBS)으로 두 번 세척하고, 펠렛을 멸균된 PBS 5mL에 재현탁시킨다.
- Beer-Lambert 법칙이 확인되는 OD 범위인 선형 범위를 사용하여 600nm에서 광학 밀도를 사용하여 박테리아 농도를 정량합니다(OD = kN, k 는 분자 소멸 및 광학 경로의 길이에 대한 계수, N 은 박테리아 농도)16. 그런 다음 멸균 PBS를 사용하여 샘플을 105 cells/mL로 희석합니다.
- 트립신 대두 한천(TSA)을 고압증기멸균으로 멸균한 다음 온도가 45°C에 도달할 때까지 혼합하여 냉각합니다. 박테리아를 TSA에 접종하십시오.
- 희석된 박테리아 배양액(100 μL)을 이식형 센서의 표면에 피펫팅합니다.
참고: 임플란트를 70% 에탄올에 5분 동안 담가 멸균하고 멸균 PBS에 보관했습니다. - 대조군으로 다른 멸균 임플란트 위에 접종되지 않은 TSA 100μL를 피펫으로 주입합니다.
- 이식 전 37°C에서 48시간 동안 배양하기 전에 이식형 센서 위에 접종되지 않은 TSA 100μL를 추가합니다.
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Representative Results
예비 연구로서, 우리는 토끼 사체14의 경골에서 골수내 막대 센서를 이미지화했습니다. 센서에는 기준 영역, pH 8 영역(염기성 pH) 및 pH 4 영역(산성 pH)의 세 가지 영역이 있습니다. 기준 영역은 거친 에폭시 필름에 통합된 섬광체(Gd 2 O2S:Eu) 입자입니다. 독특한 산성 및 염기성 pH 영역은 골수내관 내부의 감염 및 비감염 상황을 나타냅니다(그림 6A,B)14.
스캔을 완료한 후 각각 620nm, 700nm 및 비율(그림 7A-C)의 이미지를 MATLAB에서 생성했습니다. 색상의 변화는 pH의 변화를 나타냅니다. 염기성 pH 영역의 브로모티몰 블루는 산성 pH 영역보다 방출된 빛을 상당히 흡수하므로 낮은 pH 영역은 620nm에서 더 밝은 신호로 나타납니다. 700nm에서의 신틸레이터 방출은 신틸레이터 필름의 불일치, 조직 구성 변화 및 스캔에서 스캔까지 검출 광학 위치에서 발생하는 모든 변화에 대한 스펙트럼 참조 역할을 합니다.
그림 1: 현재 사용 가능한 기술과 비교한 XELCI 이미징의 특정 기능 (A) 주요 기능; (b) 현재 이용가능한 이미징 기술과의 비교. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 감염 유무에 관계없이 기술 및 센서 동작의 작동 원리. (A) 집속된 X선 빔으로 조사된 임플란트 및 검출을 위해 수집된 발광을 보여주는 개략도; (b) 섬광체 및 pH 감응형 필름이 코팅된 골수내 막대 센서의 확대도; (C) 감염으로 인한 낮은 pH에서 골수내 막대 센서가 파란색에서 노란색으로 변하는 반면 무염료 기준 영역은 변하지 않습니다. (d) 감염 동안 골수내 막대의 확대 보기; (e) pH 7 및 pH 4에서 에폭시-PEG pH 센서 필름(Gd2O2S:Eu 신틸레이터 입자를 함유하는 에폭시 필름 상부에 코팅된 브로모크레졸 그린 pH염료를 함유하는 10% PEG 하이드로겔) 및 pH 지시약이 없는 에폭시 신틸레이터 층 PEG 하이드로겔을 나타내는 스펙트럼. 이 그림은 Uzair et al.14의 허가를 받아 복제되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 이미징 시스템. (A) 개략도(빨간색 화살표는 PMT를 향한 빛의 방향을 나타냄); (B) 실제 시스템의 사진. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 치수를 보여주는 컴퓨터 지원 설계 소프트웨어 도면. (A) 90° 엘보의 그림 (B) 일체형 아크릴 도광판 그리기. (모든 치수는 mm 단위입니다) 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 이미징 절차의 흐름도 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 토끼 사체의 경골에 있는 골수내 막대 센서. (A) Gd 2 O2S로 코팅 된 스테인레스 스틸 막대 : Eu 통합 에폭시 및 pH 민감성아크릴 아미드 -PEG 겔; (b) 코팅된 스테인리스-강철 막대를 토끼 경골의 천공된 구멍에 삽입한다. 이 그림은 Uzair et al.14의 허가를 받아 복제되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7: 골수내관의 막대 센서 이미지. (a) 620nm 파장에 대한 분석된 이미지; (b) 700 nm 파장에 대한 분석 이미지; (c) 분석비율 이미지(620/700); (d) 막대 센서의 일반 방사선 사진; (E) 중첩 비율 이미지 및 일반 방사선 촬영. 이 그림은 Uzair et al.14의 허가를 받아 복제되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 표면별 이미징 | 평형/비평형 | 조직을 통한 고해상도 | 이온화 방사선 | 쉽게 겹쳐지는 X선 | 대표 참고 문헌 | |
| pH 미세전극 | 예, 한 번에 한 지점씩 | 비평형, (Nernst Equation) 오염 및 시간은 드리프트를 유발할 수 있습니다. | 예, 한 번에 한 지점씩 | 아니요 | 아니요 | 23-25 |
| 형광 pH 표시기 | 예 | 평형 | 아니요 | 아니요 | 아니요 | 18,26 |
| MRI (CEST) (MRI) (MRI) (영어) | 예 | 평형 | 3D이지만 느림 | 아니요 | 아니요 | 27 |
| XELCI (영어) | 예 | 평형 | 예 | 예 | 예 | 14,15,22 |
표 1: XELCI와 다른 pH 이미징 기법의 특징.
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Discussion
정형외과용 임플란트 관련 감염을 조기에 발견하고 연구하여 골수염 및 2차 수술로 인한 합병증을 예방할 수 있도록, XELCI를 새로운 기능적 영상 기술로 도입했습니다. 조직을 통한 pH 모니터링을 위해 현재 사용 가능한 기술과 비슷합니다.
이미징을 위해 샘플을 배치하는 동안 90° 각도로 교차하는 두 개의 선 모양 레이저 포인터가 있는 다모세관 초점 광학 장치에 연결된 레이저 크로스 헤드를 사용하여 그 아래에 엘보를 정확하게 정렬합니다. 이 레이저는 섬광체에서 생성된 빛 외에 감지기에 도달하는 원치 않는 빛을 제거하기 위해 스캔을 시작하기 전에 꺼야 합니다. 거리 측면에서 사용자는 실험을 시작하기 전에 초점 광학 장치의 끝에서 샘플 상단까지의 거리를 약 5-5.5cm로 측정합니다. 이것은 X선 소스를 수동으로 올리거나 스테이지를 위아래로 움직여 달성할 수 있습니다. 동물을 마취시키고 이소플루란 가스관을 작동시켜 잠들었다고 말하는 것을 제외하고는 살아있는 동물이나 조직을 통한 측정에도 동일한 절차가 사용됩니다. 우리는 주기적으로 온도와 맥박을 모니터링하고 동물의 해부학, 특히 각도를 적절하게 배치하기 위해 추가 침구와 테이프를 추가하며, 5-5.5cm의 초점 위치를 피부의 상단 표면까지의 거리를 사용하는 것이 아니라 임플란트의 깊이로 추정합니다. 정확한 위치를 확인하기 위해 일반 X선 이미지 또는 거친 스캔을 촬영한 후 나중에 동일한 지점에서 촬영한 화학적 XELCI 이미지와 겹쳐 촬영하는 경우가 많습니다. 조직으로 덮이지 않은 센서의 경우 일반적으로 PMT가 포화되지 않도록 X선 소스 전류가 50kV에서 최대 600μA에서 15μA까지 감소합니다. X선 소스와 그 상태는 Clemson University Radiation Safety에서 주기적으로 모니터링합니다. X-ray 컨트롤러의 키는 XELCI 사용자만 사용하며 실수로 전원을 켜고 끄는 것을 방지하기 위해 항상 멀리 떨어져 있습니다. 또한 X-ray를 켜기 전에 인클로저 전면 도어의 푸시 버튼 인터록을 조심스럽게 고정해야 합니다. 인터록이 제대로 작동하지 않으면 사용자가 X-ray의 전원을 켤 수 없으며 오류가 발생합니다. X-ray가 켜져 있는 동안 실험 내내 주황색 표시등이 켜져 X-ray가 실행 중임을 모든 사람에게 경고합니다.
일반적으로 저해상도 검사와 고해상도 검사가 모두 실행됩니다. 저해상도 스캔은 더 큰 스텝 크기를 사용하고 고해상도 스캔은 더 작은 스텝 크기를 사용합니다. 스캔에 걸리는 시간은 주로 단계 크기, 스캔 속도 및 스캔 영역의 세 가지 요소에 따라 달라집니다. 예를 들어, 1mm/s의 느린 스캔 속도와 200μm의 스텝 크기로 고해상도 이미지를 위해 15mm x 15mm의 영역을 스캔하는 데 ~20분이 걸립니다. 동일한 영역을 더 낮은 해상도와 더 빠른 스캔 속도로 스캔하면 시간이 단축됩니다(예: 1mm 스텝 크기 및 5mm/s 속도는 약 1분 소요). 동물 또는 표본을 적절하게 설정하고 배치하고 임플란트의 위치를 과소 평가하기 위해 스캔하기 전에 추가 시간이 필요합니다. 동물 실험의 경우 마취 중에 체온이 너무 많이 떨어지지 않도록 체온을 모니터링합니다. 이 연구에 사용된 스캔의 X선 선량이 적기 때문에 X선 방사선으로 인한 가열은 무시할 수 있습니다. 1 Gy = 1 J/kg 국소 X선 선량과 근육17에 대한 열용량이 3.45 kJ/kg K라고 가정하면, 방사선 흡수로 인한 최대 온도 상승은 mK 미만일 것이다
방정식 1
Q- 열 에너지
m- 질량
c- 비열 용량
ΔT- 온도 변화
위의 계산에 따르면 온도 상승은 무시할 수 있습니다. 또한 이 작은 온도 상승도 혈액 순환을 통해 빠르게 소멸됩니다.
PMT의 활성 광음극 직경은 22mm입니다. 이 넓은 영역은 피부 아래의 넓은 확산 영역에서 빛을 쉽게 포착할 수 있습니다. 열로 유도된 전자 방출로 인한 암전류를 줄이기 위해 PMT는 아래의 냉각기로 냉각될 수 있습니다. 우리는 신호 감지를 위해 두 개의 서로 다른 광전자 증배관(PMT)으로 이어지는 두 개의 스트림으로 분기되는 일체형 아크릴 광 가이드를 가지고 있습니다. 이러한 시스템 개선을 통해 집광 효율을 높이고 뼈와 조직을 통해 신호를 감지할 수 있었습니다. 이전에 이 이미징 기술은 정형외과 임플란트 표면의 감염을 모니터링하는 데 사용되었으며 pH 변화14,15를 성공적으로 이미지화할 수 있었습니다. 우리는 토끼 경골의 약 2cm의 뼈와 조직을 통해 변형된 골수내 막대의 높은 신호/노이즈 이미지를 생성했습니다. 일반적으로, 산란 및 흡수에 의한 광 감쇠는 조직 두께에 따라 기하급수적으로 증가한다. 따라서 이미지화된 조직 두께, X선 선량/스캔 시간 및 공간 해상도 사이에는 상충 관계가 있습니다.
여기에 설명된 이 이미징 기술에는 이식된 프로브와 스캐너가 모두 포함됩니다. 프로브에는 X선에 의해 조사될 때 가시광선 및 NIR 빛을 생성하는 X선 신틸레이터가 포함되어 있습니다. 그것은 광도 또는 스펙트럼에 영향을 미치는 섬광체 층 위에 제조된 화학적으로 민감한 층을 가지고 있습니다. 이 응용 분야를 위해 선택된 화학적으로 민감한 층은 600nm 파장에서 pH 의존적 흡광도를 가지며 섬광체 방출(620nm 및 700nm)과 겹치는 700nm 빛에서 거의 일정한(pH 독립적) 흡광도를 갖는 Bromothymol Blue입니다. 브로모티몰 블루 또는 브로모크레졸 그린은 pH 범위에서 pK값을 가지며 임플란트 관련 감염을 모니터링하는 데 관심이 있습니다. pH 민감성 형광 비율계량 염료로 박테리아 생물막의 pH 미세 환경을 분석하는 동안 pH는 5.6(생물막 내)에서 pH 7(주변 벌크 유체)18 사이에서 변할 수 있습니다. 주입된 프로브는 또한 공간적으로 구별되는 기준 영역으로서 작용하는 pH 지시 염료가 없는 섬광체 층을 갖는다. 또한, 우리가 사용하는 섬광체 입자는 ~ 600 nm 및 ~ 700 nm 파장에서 두드러진 방출을 가지고 있습니다. 위 염료의 흡광도 스펙트럼은 Gd 2 O2S : Eu 입자의 방출 스펙트럼과 겹칩니다. 흥미진진한 X선과 적색/NIR 발광 광자는 모두 조직을 통해 전파될 수 있기 때문에 생체 내 생물의학 이미징에 활용됩니다 19,20,21.
그림 1 은 이 연구에 사용된 이미징 시스템의 세 가지 특성인 X선 분해능, 화학적 특이성 및 임플란트 표면 특이성을 보여줍니다. 이러한 특성들은 SPECT, PET, MRI, US 등과 같은 현재 이용가능한 이미징 기술들과 비교된다(22). 이러한 기술은 고해상도의 구조적/해부학적 정보를 고해상도로 제공하지만 임플란트 표면의 화학적 변화를 매핑/이미지화할 수 없었습니다. 이 기술은 광학 지시약 염료의 화학적 민감성과 코팅의 임플란트 특이성을 결합합니다. X-ray의 공간 분해능은 뼈와 조직을 통해 임플란트 표면의 화학 물질 농도에 대한 고유하고 낮은 배경 및 더 높은 공간 분해능 감지/매핑을 제공합니다.
X선 여기 발광 화학 이미징은 감염 연구를 위한 높은 공간 분해능으로 임플란트 표면의 국소 화학 환경을 연구하는 독특한 방법을 제공합니다. 미래에는 다른 지표 염료를 선택하여 다른 분석물을 모니터링하도록 접근 방식을 일반화할 수 있습니다. 섬광체 입자 및 지표 염료로 코팅된 주사 또는 이식 의료 기기를 사용하여 다른 질병 및 상태에 잠재적으로 적용할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 이해 상충이 없다고 주장합니다.
Acknowledgments
저자는 Clemson University, COMSET 및 Clemson SC BioCRAFT에 감사드립니다. XELCI 설정은 처음에 NSF CAREER CHE 12255535의 자금으로 개발되었으며 이후 NIH NIAMS R01 AR070305-01에서 개발되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 90 degree elbow | Produced in Hilltop Technology Laboratory, 51 Parker, Irvine,CA | ||
| Bromo Cresol Green | Sigma-Aldrich | 45ZW10 | |
| Bromo Thymol Blue | Sigma | 76-59-5 | |
| ElectraCOOL Advanced thermoelectric cool plate | Pollock industries, White River, VT, USA | TCP 50 | |
| Ethanol | Beantown Chemical, 9 Sagamore Park Road Hudson, NH 03051 |
64-17-5 | |
| Gadolinium Oxysulfide Europium doped (Gd2O2S:Eu) particles-~8.0 µm | Phosphor Technologies Inc., Stevenage, England | UKL63/N-R1 | |
| LabVIEW | National Instruments, Austin, TX | ||
| Motorized Linear Vertical Stage Model (for Z axis) | Motion Control, Smithtown, NY, USA | AT10-60 | |
| National instruments c-DAQ 9171 | National Instruments, Austin, TX | NI cDAQ™-9171 | |
| One piece acrylic light guide | Produced in Hilltop Technology Laboratory, 51 Parker, Irvine,CA | ||
| pH 4 buffer | VWR BDH Chemicals | BDH5024 | |
| pH 8 buffer | VWR BDH Chemicals | BDH5060 | |
| Phosphate Buffer Solution | MP Biomedicals, Irvine, CA. USA | 2810305 | |
| Photo multiplier tubes Model P25PC-16 | SensTech, Surrey, UK | Model P25PC-16 | |
| Staphylococcus aureus subsp. aureus Rosenbach | American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA | ATCC 25923 | |
| Tryptic Soy Agar | Teknova, Hollister, CA, USA | T0520 | |
| Tryptic Soy Broth | EMD Millipore, Burlington, MA, USA | 1005255000 | |
| X-ray source-iMOXS | Institute for Scientific Instruments GmbH, Berlin, Germany | ||
| X,Y motorized stage-30 cm x 15 cm x 6 cm travel | Thorlabs Inc., Newton, NJ, USA | LTS300 and LTS150 |
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